Die Verwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien
Summary
Dieser Methodenartikel beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Messung des H + -Lecks über die innere mitochondriale Membran mit der Patch-Clamp-Technik, einem neuen Ansatz zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien.
Abstract
Die mitochondriale Thermogenese (auch bekannt als mitochondriale Entkopplung) ist eines der vielversprechendsten Ziele für die Erhöhung des Energieverbrauchs zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms. Thermogene Gewebe wie braune und beige Fette entwickeln hochspezialisierte Mitochondrien zur Wärmeerzeugung. Mitochondrien anderer Gewebe, die primär ATP produzieren, wandeln ebenfalls bis zu 25% der gesamten mitochondrialen Energieproduktion in Wärme um und können daher einen erheblichen Einfluss auf die Physiologie des gesamten Körpers haben. Die mitochondriale Thermogenese ist nicht nur für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur unerlässlich, sondern beugt auch ernährungsbedingter Fettleibigkeit vor und reduziert die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), um Zellen vor oxidativen Schäden zu schützen. Da die mitochondriale Thermogenese ein Schlüsselregulator des Zellstoffwechsels ist, wird ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses bei der Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion helfen. Wichtig ist, dass die genauen molekularen Mechanismen, die die akute Aktivierung der Thermogenese in Mitochondrien steuern, schlecht definiert sind. Dieser Mangel an Informationen ist weitgehend auf einen Mangel an Methoden zur direkten Messung von entkoppelnden Proteinen zurückzuführen. Die jüngste Entwicklung der Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, ermöglichte zum ersten Mal die direkte Untersuchung des Phänomens am Ursprung der mitochondrialen Thermogenese, H + -Leck durch das IMM und die erste biophysikalische Charakterisierung der dafür verantwortlichen mitochondrialen Transporter, des Entkopplungsproteins 1 (UCP1), spezifisch für braune und beige Fette, und des ADP / ATP-Transporters (AAC) für alle anderen Gewebe. Dieser einzigartige Ansatz wird neue Einblicke in die Mechanismen liefern, die H + – Leck und mitochondriale Thermogenese kontrollieren und wie sie zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms eingesetzt werden können. Dieses Papier beschreibt die Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wird, um ihre thermogene Kapazität durch direkte Messung von H + – Strömen durch das IMM zu untersuchen.
Introduction
Mitochondrien sind berühmt dafür, das Kraftwerk der Zelle zu sein. In der Tat sind sie die wichtigste Quelle chemischer Energie, ATP. Weniger bekannt ist, dass Mitochondrien auch Wärme erzeugen. Tatsächlich erzeugt jedes Mitochondrium ständig die beiden Arten von Energien (ATP und Wärme) und ein feines Gleichgewicht zwischen den beiden Energieformen definiert die metabolische Zellhomöostase (Abbildung 1). Wie Mitochondrien Energie zwischen ATP und Wärme verteilen, ist sicherlich die grundlegendste Frage auf dem Gebiet der Bioenergetik, obwohl sie noch weitgehend unbekannt ist. Wir wissen, dass die Erhöhung der mitochondrialen Wärmeproduktion (mitochondriale Thermogenese genannt) und folglich die Verringerung der ATP-Produktion den Energieverbrauch erhöht, und dies ist eine der besten Möglichkeiten, das metabolische Syndrom zu bekämpfen1.
Die mitochondriale Thermogenese entsteht durch H+-Leck über die innere mitochondriale Membran (IMM), was zu einer Entkopplung der Substratoxidation und der ATP-Synthese mit anschließender Wärmeerzeugung führt, daher der Name “mitochondriale Entkopplung”1 (Abbildung 1). Dieses H + –Leck hängt von mitochondrialen Transportern ab, die als Entkopplungsproteine (UCPs) bezeichnet werden. UCP1 war der erste identifizierte UCP. Es wird nur in thermogenen Geweben, braunem Fett und beigefarbenem Fett exprimiert, in denen Mitochondrien auf die Wärmeerzeugung spezialisiert sind 2,3,4. Die Identität von UCP in Nicht-Fettgeweben wie Skelettmuskulatur, Herz und Leber ist umstritten geblieben. Mitochondrien in diesen Geweben können etwa 25% der gesamten mitochondrialen Energie in Wärme umgewandelt werden, was die Physiologie des gesamten Körpers erheblich beeinflussen kann1. Neben der Aufrechterhaltung der Körperkerntemperatur verhindert die mitochondriale Thermogenese auch ernährungsbedingte Fettleibigkeit durch Reduzierung der Kalorien. Darüber hinaus reduziert es die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Mitochondrien, um Zellen vor oxidativen Schädenzu schützen 1. So ist die mitochondriale Thermogenese an normalem Altern, altersbedingten degenerativen Erkrankungen und anderen Erkrankungen mit oxidativem Stress wie Ischämie-Reperfusion beteiligt. Daher ist die mitochondriale Thermogenese ein starker Regulator des Zellstoffwechsels, und ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses wird die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion fördern.
Die mitochondriale Atmung war die erste Technik, die die entscheidende Rolle der mitochondrialen Thermogenese im Zellstoffwechsel aufdeckte und ist immer noch die beliebteste in der Gemeinschaft1. Diese Technik basiert auf der Messung des Sauerstoffverbrauchs durch die mitochondriale Elektronentransportkette (ETC), die zunimmt, wenn das mitochondriale H+-Leck aktiviert wird. Diese Technik, obwohl instrumentell, kann nicht direkt mitochondrialen H + -Lecks über das IMM1 untersuchen, wodurch die genaue Identifizierung und Charakterisierung der dafür verantwortlichen Proteine erschwert wird, insbesondere in Nicht-Fettgeweben, in denen die Wärmeproduktion im Vergleich zur ATP-Produktion sekundär ist. Vor kurzem lieferte die Entwicklung der Patch-Clamp-Technik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, die erste direkte Studie des H + –Lecks über das gesamte IMM in verschiedenen Geweben 5,6,7.
Die mitochondriale Patch-Klemme des gesamten IMM wurde erstmals reproduzierbar von Kirichok et al.8 etabliert. Sie beschrieben die erste direkte Messung von mitochondrialen Calcium-Uniporter-Strömen (MCU) im Jahr 2004 mit Mitoplasten aus COS-7-Zelllinien8. Später zeigte das Kirichok-Labor Kalziumströme aus IMMs von Maus 9 und Drosophila Gewebe9. Andere Labore verwenden diese Technik nun routinemäßig, um die biophysikalischen Eigenschaften der MCU 10,11,12,13,14 zu untersuchen. Die gesamte IMM-Patch-Clamp-Analyse des Kalium- und Chloridleitwerts ist ebenfalls möglich und wurde in mehreren Artikeln erwähnt, war aber noch nicht das Hauptthema einer Veröffentlichung 6,7,9. Die erste Messung der H + -Ströme im gesamten IMM wurde 2012 von Maus-Braunfett-Mitochondrien6 und von Maus-Beigefett-Mitochondrien im Jahr 20177 berichtet. Dieser Strom ist auf das spezifische Entkopplungsprotein thermogener Gewebe, UCP16,7, zurückzuführen. Jüngste Arbeiten, die 2019 veröffentlicht wurden, charakterisierten AAC als das Hauptprotein, das für das mitochondriale H + -Leck in Nicht-Fettgeweben wie Herz und Skelettmuskulatur verantwortlich ist 5.
Dieser einzigartige Ansatz ermöglicht nun die direkte hochauflösende Funktionsanalyse der mitochondrialen Ionenkanäle und Transporter, die für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich sind. Um die Erweiterung der Methode zu erleichtern und andere Studien wie die mitochondriale Atmung zu ergänzen, wird im Folgenden ein detailliertes Protokoll zur Messung der H + –Ströme beschrieben, die von UCP1 und AAC übertragen werden. Drei wichtige Schritte werden beschrieben: 1) mitochondriale Isolierung von braunem Mausfett zur Analyse des UCP1-abhängigen H + -Stroms und der mitochondrialen Isolierung vom Herzen, um den AAC-abhängigen H + -Strom zu analysieren, 2) Vorbereitung von Mitoplasten mit einer französischen Presse für den mechanischen Bruch der äußeren mitochondrialen Membran (OMM), 3) Patch-Clamp-Aufnahmen von UCP1- und AAC-abhängigen H + –Strömen über das gesamte IMM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Methodenartikel zielt darauf ab, die Patch-Clamp-Technik vorzustellen, die kürzlich auf Mitochondrien angewendet wurde, einen neuen Ansatz zur direkten Untersuchung von H + –Leck durch das IMM, das für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich ist 5,6,7,15. Diese Technik ist nicht auf Gewebe beschränkt und kann auch zur Analyse von H + -Lecks und anderen Leitwerten des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich danke Dr. Yuriy Kirichok für die großartige Wissenschaft, an der ich in seinem Labor beteiligt war, und den Mitgliedern des Kirichok-Labors für die hilfreichen Diskussionen. Ich danke auch Dr. Douglas C. Wallace für die Bereitstellung von AAC1-Knockout-Mäusen . Finanzierung: A.M.B wurde durch einen American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062 unterstützt.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
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