Bu yöntem makalesi, mitokondrinin termojenik kapasitesini incelemek için yeni bir yaklaşım olan yama-kelepçe tekniği ile iç mitokondriyal membran boyunca H + sızıntısını ölçmedeki ana adımları detaylandırmaktadır.
Mitokondriyal termogenez (mitokondriyal ayrılma olarak da bilinir), metabolik sendromla mücadele etmek için enerji harcamasını artırmak için en umut verici hedeflerden biridir. Kahverengi ve bej yağlar gibi termojenik dokular, ısı üretimi için oldukça uzmanlaşmış mitokondri geliştirir. Öncelikle ATP üreten diğer dokuların mitokondrileri, toplam mitokondriyal enerji üretiminin% 25’ini ısıya dönüştürür ve bu nedenle tüm vücudun fizyolojisi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Mitokondriyal termojenez sadece vücut ısısını korumak için gerekli değildir, aynı zamanda diyete bağlı obeziteyi önler ve hücreleri oksidatif hasardan korumak için reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır. Mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın önemli bir düzenleyicisi olduğundan, bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Önemli olarak, mitokondride termojenezin akut aktivasyonunu kontrol eden hassas moleküler mekanizmalar zayıf bir şekilde tanımlanmıştır. Bu bilgi eksikliği, büyük ölçüde, ayrıştırıcı proteinlerin doğrudan ölçümü için yöntemlerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Mitokondriye uygulanan yama-kelepçe metodolojisinin son zamanlardaki gelişimi, ilk kez, mitokondriyal termogenezin kökenindeki fenomenin doğrudan incelenmesini, İBB’den H + sızıntısını ve bundan sorumlu mitokondriyal taşıyıcıların ilk biyofiziksel karakterizasyonunu, kahverengi ve bej yağlara özgü ayrışma proteini 1’i (UCP1) ve diğer tüm dokular için ADP / ATP taşıyıcısını (AAC) mümkün kılmıştır. Bu benzersiz yaklaşım, H + sızıntısını ve mitokondriyal termojenezi kontrol eden mekanizmalara ve metabolik sendromla mücadele için nasıl hedeflenebileceklerine dair yeni bilgiler sağlayacaktır. Bu makalede, İBB aracılığıyla H + akımlarını doğrudan ölçerek termojenik kapasitelerini incelemek için mitokondrilere uygulanan yama kelepçesi metodolojisi açıklanmaktadır.
Mitokondri, hücrenin güç merkezi olmasıyla ünlüdür. Aslında, kimyasal enerjinin ana kaynağı olan ATP’dirler. Daha az bilinen şey, mitokondrinin de ısı ürettiğidir. Aslında, her mitokondri sürekli olarak iki tür enerji (ATP ve ısı) üretir ve iki enerji formu arasındaki ince bir denge metabolik hücre homeostazını tanımlar (Şekil 1). Mitokondrinin ATP ve ısı arasında enerjiyi nasıl dağıttığı, biyoenerjetik alanındaki en temel sorudur, ancak hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Mitokondriyal ısı üretimini arttırmanın (mitokondriyal termojenez olarak adlandırılır) ve sonuç olarak ATP üretimini azaltmanın enerji harcamasını artırdığını biliyoruz ve bu, metabolik sendromla mücadele etmenin en iyi yollarından biridir1.
Mitokondriyal termogenez, iç mitokondriyal membran (IMM) boyunca H + sızıntısından kaynaklanır ve substrat oksidasyonunun ve ATP sentezinin ısı üretimi ile ayrılmasına yol açar, bu nedenle “mitokondriyal ayrışma”1 adı verilir (Şekil 1). Bu H + sızıntısı, ayrışma proteinleri (UCP’ler) adı verilen mitokondriyal taşıyıcılara bağlıdır. UCP1, tanımlanan ilk UCP’dir. Sadece termojenik dokularda, kahverengi yağda ve mitokondrinin ısı üretimi için uzmanlaşmış olduğu bej yağda ifade edilir 2,3,4. İskelet kası, kalp ve karaciğer gibi yağ olmayan dokularda UCP’nin kimliği tartışmalı kalmıştır. Bu dokulardaki mitokondri, ısıya dönüştürülen toplam mitokondriyal enerjinin yaklaşık% 25’ine sahip olabilir ve bu da tüm vücudun fizyolojisini önemli ölçüde etkileyebilir1. Çekirdek vücut ısısını korumanın yanı sıra, mitokondriyal termogenez ayrıca kalorileri azaltarak diyete bağlı obeziteyi de önler. Ek olarak, hücreleri oksidatif hasardan korumak için mitokondri ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır1. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez normal yaşlanma, yaşa bağlı dejeneratif bozukluklar ve iskemi-reperfüzyon gibi oksidatif stres içeren diğer durumlarda rol oynar. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın güçlü bir düzenleyicisidir ve bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesini teşvik edecektir.
Mitokondriyal solunum, mitokondriyal termogenezin hücresel metabolizmadaki önemli rolünü ortaya koyan ilk tekniktir ve hala toplumda en popüler olanıdır1. Bu teknik, mitokondriyal H + sızıntısı aktive edildiğinde artan mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) tarafından oksijen tüketiminin ölçülmesine dayanmaktadır. Bu teknik, enstrümantal olmasına rağmen, İBB1’deki mitokondriyal H + sızıntısını doğrudan inceleyemez, böylece özellikle ısı üretiminin ATP üretimine kıyasla ikincil olduğu yağ dışı dokularda, bundan sorumlu proteinlerin kesin olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu zorlaştırır. Son zamanlarda, mitokondriye uygulanan yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi, çeşitli dokularda tüm İBB’de H + sızıntısının ilk doğrudan çalışmasını sağlamıştır 5,6,7.
Tüm İBB’nin mitokondriyal yama kelepçesi ilk olarak Kirichok ve ark.8 tarafından tekrarlanabilir bir şekilde kurulmuştur. 2004 yılında mitokondriyal kalsiyum uniporter (MCU) akımlarının ilk doğrudan ölçümünü, COS-7 hücre hatlarından mitoplastlar kullanarak tanımladılar8. Daha sonra, Kirichok laboratuvarı, fare 9 ve Drosophila dokuları9’un IMM’lerinden kalsiyum akımları gösterdi. Diğer laboratuvarlar şimdi MCU10,11,12,13,14’ün biyofiziksel özelliklerini incelemek için bu tekniği rutin olarak kullanmaktadır. Potasyum ve klorür iletkenliğinin tüm İBB yama-kelepçe analizi de mümkündür ve birkaç makalede bahsedilmiştir, ancak henüz bir yayının ana konusu olmamıştır 6,7,9. İBB’deki H + akımlarının ilk ölçümü 2012 yılında fare kahverengi yağ mitokondrisi6’dan ve 2017’de fare bej yağ mitokondrisinden7 bildirilmiştir. Bu akım, termojenik dokuların spesifik ayrışma proteini UCP1 6,7’den kaynaklanmaktadır. 2019’da yayınlanan son çalışmalar, AAC’yi kalp ve iskelet kası gibi yağ dışı dokularda mitokondriyal H + sızıntısından sorumlu ana protein olarak nitelendirdi5.
Bu benzersiz yaklaşım şimdi mitokondriyal iyon kanallarının ve mitokondriyal termojenezden sorumlu taşıyıcıların doğrudan yüksek çözünürlüklü fonksiyonel analizine izin vermektedir. Yöntemin genişlemesini kolaylaştırmak ve mitokondriyal solunum gibi diğer çalışmaları tamamlamak için, UCP1 ve AAC tarafından taşınan H + akımlarını ölçmek için aşağıda ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Üç önemli adım açıklanmaktadır: 1) AAC’ye bağımlı H + akımını analiz etmek için fare kahverengi yağından mitokondriyal izolasyon ve AAC’ye bağımlı H + akımını analiz etmek için kalpten mitokondriyal izolasyon, 2) dış mitokondriyal membranın (OMM) mekanik rüptürü için bir Fransız Basını ile mitoplastların hazırlanması, 3) UCP1 ve AAC’ye bağımlı H + akımlarının yama-kelepçe kayıtları.
Bu yöntem makalesi, mitokondriyal termojenezden sorumlu İBB aracılığıyla H + sızıntısını doğrudan incelemek için yeni bir yaklaşım olan mitokondriye yakın zamanda uygulanan yama-kelepçe tekniğini sunmayı amaçlamaktadır 5,6,7,15. Bu teknik dokularla sınırlı değildir ve HAP1, COS7, C2C12 ve MEF hücreleri gibi farklı standart insan ve hücre modellerinde İBB’…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Yuriy Kirichok’a laboratuvarında parçası olduğum büyük bilim için ve Kirichok laboratuvarının üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca AAC1 nakavt fareleri sağladığı için Dr. Douglas C. Wallace’a teşekkür ederim. Finansman: A.M.B, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 19CDA34630062 tarafından desteklenmiştir.
0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
Faraday cage | Homemade | ||
French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
pClamp 10 | Molecular Devices | ||
Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
Chemicals | |||
D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |