미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용
Summary
이 방법 기사는 미토콘드리아의 열 생성 능력을 연구하기위한 새로운 접근 방식 인 패치 클램프 기술로 내부 미토콘드리아 막을 가로 지르는 H + 누출을 측정하는 주요 단계를 자세히 설명합니다.
Abstract
미토콘드리아 열발생(미토콘드리아 비결합이라고도 함)은 대사 증후군과 싸우기 위해 에너지 소비를 증가시키는 가장 유망한 목표 중 하나입니다. 갈색 및 베이지 색 지방과 같은 열 생성 조직은 열 생산을 위해 고도로 전문화 된 미토콘드리아를 개발합니다. 주로 ATP를 생산하는 다른 조직의 미토콘드리아도 전체 미토콘드리아 에너지 생산의 최대 25 %를 열로 변환하므로 전신의 생리학에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아 열발생은 체온 유지에 필수적일 뿐만 아니라 식이요법으로 인한 비만을 예방하고 반응성 산소종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호합니다. 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 핵심 조절자이기 때문에, 이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리와 싸우기 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것이다. 중요하게도, 미토콘드리아에서 열발생의 급성 활성화를 조절하는 정확한 분자 메커니즘은 제대로 정의되지 않았다. 이러한 정보의 부족은 주로 언커플링 단백질의 직접적인 측정을 위한 방법의 부족 때문이다. 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 최근 개발은 처음으로 미토콘드리아 열발생의 기원에서의 현상에 대한 직접적인 연구, IMM을 통한 H+ 누출, 그리고 이를 담당하는 미토콘드리아 운반체의 첫 번째 생물물리학적 특성화, 갈색 및 베이지 색 지방의 특이적인 단백질 1(UCP1), 그리고 다른 모든 조직에 대한 ADP/ATP 수송체(AAC)를 가능하게 했다. 이 독특한 접근법은 H + 누출 및 미토콘드리아 열 발생을 제어하는 메커니즘과 대사 증후군 퇴치를 목표로하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 논문은 IMM을 통해 H+ 전류를 직접 측정하여 열원성 능력을 연구하기 위해 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론을 설명합니다.
Introduction
미토콘드리아는 세포의 강국으로 유명합니다. 실제로, 그들은 화학 에너지의 주요 원천 인 ATP입니다. 덜 알려진 것은 미토콘드리아도 열을 발생시킨다는 것입니다. 사실, 모든 미토콘드리온은 두 가지 유형의 에너지 (ATP와 열)를 지속적으로 생성하며 두 에너지 형태 사이의 미세한 균형은 대사 세포 항상성을 정의합니다 (그림 1). 미토콘드리아가 ATP와 열 사이에 에너지를 분배하는 방법은 아직 크게 알려지지 않았지만 생물 에너지 분야에서 가장 근본적인 질문입니다. 우리는 미토콘드리아 열 생산 (미토콘드리아 열 발생이라고 함)을 증가시키고 결과적으로 ATP 생산을 줄이면 에너지 소비가 증가한다는 것을 알고 있으며 이는 대사 증후군1과 싸우는 가장 좋은 방법 중 하나입니다.
미토콘드리아 열발생은 미토콘드리아 내부 막(IMM)을 가로지르는 H+ 누출로 인해 기질 산화와 ATP 합성의 결합이 해제되어 결과적으로 열이 생성되므로 “미토콘드리아 비결합”1이라는 이름이 붙여집니다(그림 1). 이 H+ 누출은 언커플링 단백질(UCPs)이라고 불리는 미토콘드리아 수송체에 의존한다. UCP1은 최초로 확인된 UCP였다. 그것은 열원성 조직, 갈색 지방 및 미토콘드리아가 열 생산을 전문으로하는 베이지 색 지방에서만 발현됩니다 2,3,4. 골격근, 심장 및 간과 같은 비 지방 조직에서 UCP의 정체성은 논란의 여지가있다. 이들 조직 내의 미토콘드리아는 열로 변환된 총 미토콘드리아 에너지의 약 25%를 가질 수 있으며, 이는 전신의 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있다1. 핵심 체온을 유지하는 것 외에도 미토콘드리아 열 발생은 칼로리를 줄임으로써식이 요법으로 인한 비만을 예방합니다. 또한, 미토콘드리아에 의한 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호한다1. 따라서, 미토콘드리아 열발생은 정상적인 노화, 연령-관련 퇴행성 장애, 및 허혈-재관류와 같은 산화 스트레스를 수반하는 다른 병태에 관여한다. 따라서 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 강력한 조절자이며,이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리학을 퇴치하기위한 치료 전략의 개발을 촉진 할 것입니다.
미토콘드리아 호흡은 세포 대사에서 미토콘드리아 열발생의 중요한 역할을 밝혀내는 최초의 기술이었으며 여전히 지역 사회에서 가장 인기가 있습니다1. 이 기술은 미토콘드리아 H+ 누출이 활성화될 때 증가하는 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)에 의한 산소 소비량 측정을 기반으로 합니다. 이 기술은 도구적이지만 IMM1에서 미토콘드리아 H+ 누출을 직접 연구할 수는 없으므로 특히 ATP 생산과 비교하여 열 생산이 이차적인 비지방 조직에서는 이를 담당하는 단백질의 정확한 식별 및 특성화가 어렵습니다. 최근에, 미토콘드리아에 적용된 패치-클램프 기술의 개발은, 다양한 조직들(5,6,7)에서 전체 IMM에 걸친 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공하였다.
전체 IMM의 미토콘드리아 패치 클램프는 Kirichok et al.8에 의해 재현 가능한 방식으로 처음 확립되었습니다. 그들은 COS-7 세포주8의 미토플라스트를 사용하여 2004 년 미토콘드리아 칼슘 유니포터 (MCU) 전류의 첫 번째 직접 측정을 설명했습니다. 나중에, Kirichok 실험실은 마우스 9 및 초파리 조직9의 IMM에서 칼슘 전류를보여주었습니다. 다른 실험실에서는 MCU10,11,12,13,14의 생물 물리학 적 특성을 연구하기 위해이 기술을 일상적으로 사용합니다. 칼륨 및 염화물 전도도의 전체 IMM 패치-클램프 분석도 가능하며, 몇몇 논문에서 언급되었지만, 아직 간행물 6,7,9의 주요 주제가 되지 않았다. IMM을 통한 H+ 전류의 첫 번째 측정은 2012년 마우스 갈색 지방 미토콘드리아(6)로부터, 그리고 2017년 마우스 베이지색 지방 미토콘드리아(2017년7)로부터 보고되었다. 이러한 전류는 열원성 조직인 UCP1 6,7의 특이적 비결합 단백질에 기인한다. 2019 년에 발표 된 최근 연구는 AAC를 심장 및 골격근과 같은 비 지방 조직에서 미토콘드리아 H + 누출을 담당하는 주요 단백질로 특성화했습니다5.
이 독특한 접근 방식은 이제 미토콘드리아 이온 채널 및 미토콘드리아 열 발생을 담당하는 수송체의 직접적인 고해상도 기능 분석을 허용합니다. 이 방법의 확장을 촉진하고 미토콘드리아 호흡과 같은 다른 연구를 보완하기 위해 UCP1 및 AAC에 의해 운반되는 H + 전류를 측정하기위한 상세한 프로토콜이 아래에 설명되어 있습니다. 세 가지 중요한 단계가 설명된다: 1) AAC 의존성 H+ 전류를 분석하기 위해 UCP1 의존성 H+ 전류 및 심장으로부터의 미토콘드리아 분리를 분석하기 위한 마우스 갈색 지방으로부터의 미토콘드리아 분리, 2) 외부 미토콘드리아 막(OMM)의 기계적 파열을 위한 프렌치 프레스를 이용한 미토플라스트 준비, 3) 전체 IMM에 걸친 UCP1 및 AAC 의존적 H+ 전류의 패치 클램프 기록.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법 논문은 미토콘드리아에 최근에 적용된 패치 클램프 기술을 제시하는 것을 목표로하며, 미토콘드리아 열발생 5,6,7,15를 담당하는 IMM을 통해 H + 누출을 직접 연구하는 새로운 접근 방식입니다. 이 기술은 조직에 한정되지 않으며, HAP1, COS7, C2C12 및 MEF 세포와 같은 상이한 표준 인간 및 세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
나는 Yuriy Kirichok 박사에게 내가 그의 실험실에서 참여했던 위대한 과학과 도움이되는 토론을 위해 Kirichok 실험실의 구성원들에게 감사한다. 또한 AAC1 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Douglas C. Wallace 박사님께도 감사드립니다. 기금: A.M.B는 American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
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