Использование метода patch-clamp для изучения термогенной способности митохондрий
Summary
В этой статье подробно описываются основные этапы измерения утечки H+ через внутреннюю митохондриальную мембрану с помощью метода пластырного зажима, нового подхода к изучению термогенной способности митохондрий.
Abstract
Митохондриальный термогенез (также известный как митохондриальное разъединение) является одной из наиболее перспективных целей для увеличения расхода энергии для борьбы с метаболическим синдромом. Термогенные ткани, такие как коричневые и бежевые жиры, развивают узкоспециализированные митохондрии для производства тепла. Митохондрии других тканей, которые в первую очередь вырабатывают АТФ, также преобразуют до 25% от общего производства митохондриальной энергии в тепло и могут, следовательно, оказывать значительное влияние на физиологию всего организма. Митохондриальный термогенез не только необходим для поддержания температуры тела, но также предотвращает ожирение, вызванное диетой, и снижает выработку активных форм кислорода (АФК) для защиты клеток от окислительного повреждения. Поскольку митохондриальный термогенез является ключевым регулятором клеточного метаболизма, механистическое понимание этого фундаментального процесса поможет в разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией. Важно отметить, что точные молекулярные механизмы, которые контролируют острую активацию термогенеза в митохондриях, плохо определены. Этот недостаток информации во многом связан с нехваткой методов прямого измерения разъединяющихся белков. Недавняя разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, позволила впервые непосредственно изучить явление, лежащее в основе митохондриального термогенеза, утечку H+ через ИММ, и первую биофизическую характеристику митохондриальных транспортеров, ответственных за него, разъединяющего белка 1 (UCP1), специфичного для бурых и бежевых жиров, и транспортера АДФ/АТФ (AAC) для всех других тканей. Этот уникальный подход даст новое представление о механизмах, которые контролируют утечку H + и митохондриальный термогенез, и о том, как они могут быть нацелены на борьбу с метаболическим синдромом. В этой статье описывается методология зажимов, применяемая к митохондриям для изучения их термогенной способности путем непосредственного измерения токов H+ через IMM.
Introduction
Митохондрии славятся тем, что являются электростанцией клетки. Действительно, они являются основным источником химической энергии, АТФ. Что менее известно, так это то, что митохондрии также генерируют тепло. Фактически, каждая митохондрия постоянно генерирует два типа энергий (АТФ и тепло), а тонкий баланс между двумя энергетическими формами определяет метаболический гомеостаз клеток (рисунок 1). Как митохондрии распределяют энергию между АТФ и теплом, безусловно, является самым фундаментальным вопросом в области биоэнергетики, хотя он до сих пор в значительной степени неизвестен. Мы знаем, что увеличение производства митохондриального тепла (называемое митохондриальным термогенезом) и, следовательно, снижение производства АТФ увеличивает расход энергии, и это один из лучших способов борьбы с метаболическим синдромом1.
Митохондриальный термогенез возникает из-за утечки H+ через внутреннюю митохондриальную мембрану (IMM), что приводит к разъединению окисления субстрата и синтеза АТФ с последующим производством тепла, отсюда и название «митохондриальное разъединение»1 (рисунок 1). Эта утечка H+ зависит от митохондриальных транспортеров, называемых разъединяющими белками (UCP). UCP1 был первым идентифицированным UCP. Он выражается только в термогенных тканях, буром жире и бежевом жире, в которых митохондрии специализируются на производстве тепла 2,3,4. Идентичность UCP в нежировых тканях, таких как скелетные мышцы, сердце и печень, остается спорной. Митохондрии в этих тканях могут иметь около 25% общей митохондриальной энергии, преобразованной в тепло, что может значительно повлиять на физиологию всего тела1. Помимо поддержания температуры тела, митохондриальный термогенез также предотвращает ожирение, вызванное диетой, уменьшая калории. Кроме того, он уменьшает выработку активных форм кислорода (АФК) митохондриями для защиты клеток от окислительного повреждения1. Таким образом, митохондриальный термогенез участвует в нормальном старении, возрастных дегенеративных расстройствах и других состояниях, связанных с окислительным стрессом, таких как ишемия-реперфузия. Поэтому митохондриальный термогенез является мощным регулятором клеточного метаболизма, и механистическое понимание этого фундаментального процесса будет способствовать разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией.
Митохондриальное дыхание было первым методом, раскрывшим решающую роль митохондриального термогенеза в клеточном метаболизме и до сих пор является самым популярным в сообществе1. Этот метод основан на измерении потребления кислорода митохондриальной цепью переноса электронов (ETC), которая увеличивается при активации утечки митохондриального H+. Этот метод, хотя и инструментальный, не может непосредственно изучать утечку митохондриального H+ через IMM1, тем самым затрудняя точную идентификацию и характеристику белков, ответственных за него, особенно в нежировых тканях, в которых производство тепла является вторичным по сравнению с производством АТФ. Недавно разработка метода пластыря-зажима, применяемого к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H+ по всему ИММ в различных тканях 5,6,7.
Митохондриальный пластырь-зажим всего ИММ был впервые установлен воспроизводимым способом Kirichok et al.8. Они описали первое прямое измерение токов митохондриального юнипортера кальция (MCU) в 2004 году с использованием митопластов из клеточных линий COS-78. Позже лаборатория Kirichok показала токи кальция из IMM тканей мыши9 и дрозофилы 9. Другие лаборатории в настоящее время регулярно используют этот метод для изучения биофизических свойств MCU 10,11,12,13,14. Анализ проводимости калия и хлорида также возможен и упоминался в нескольких статьях, но еще не был основным предметом публикации 6,7,9. Первое измерение токов H+ через IMM было зарегистрировано в 2012 году из митохондрий бурого жира мыши6 и из митохондрий мышиного бежевого жира в 2017году 7. Этот ток обусловлен специфическим разъединяющим белком термогенных тканей UCP1 6,7. Недавняя работа, опубликованная в 2019 году, охарактеризовала AAC как основной белок, ответственный за утечку митохондриального H+ в нежировых тканях, таких как сердце и скелетные мышцы5.
Этот уникальный подход теперь позволяет проводить прямой функциональный анализ с высоким разрешением митохондриальных ионных каналов и транспортеров, ответственных за митохондриальный термогенез. Чтобы облегчить расширение метода и дополнить другие исследования, такие как митохондриальное дыхание, ниже описан подробный протокол измерения токов H+ , переносимых UCP1 и AAC. Описаны три важных шага: 1) выделение митохондрий из мышиного бурого жира для анализа UCP1-зависимого тока H+ и митохондриальная изоляция от сердца для анализа AAC-зависимого тока H+ , 2) подготовка митопластов с помощью френч-пресса для механического разрыва внешней митохондриальной мембраны (OMM), 3) записи зажимов UCP1 и AAC-зависимых токов H+ по всему ИММ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья о методе направлена на то, чтобы представить метод зажимов, недавно примененный к митохондриям, новый подход к непосредственному изучению утечки H+ через IMM, ответственный за митохондриальный термогенез 5,6,7,15.<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я благодарю доктора Юрия Киричка за великую науку, частью которой я был в его лаборатории, и членов лаборатории Киричка за полезные дискуссии. Я также благодарю доктора Дугласа К. Уоллеса за предоставление нокаутирующих мышей AAC1 . Финансирование: A.M.B была поддержана премией Американской кардиологической ассоциации за развитие карьеры 19CDA34630062.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
