Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per la messa a punto delle regioni di interesse (ROI) per le tecnologie di omiche spaziali per caratterizzare meglio il microambiente tumorale e identificare specifiche popolazioni cellulari. Per i saggi di proteomica, i protocolli personalizzati automatizzati possono guidare la selezione del ROI, mentre i saggi di trascrittomica possono essere ottimizzati utilizzando ROI di soli 50 μm.
Abstract
Il multiplexing consente la valutazione di diversi marcatori sullo stesso tessuto, fornendo al contempo un contesto spaziale. Le tecnologie di omiche spaziali consentono il multiplexing sia di proteine che di RNA sfruttando rispettivamente anticorpi e sonde oligo-marcati foto-scissibili. Gli oligo vengono scissi e quantificati da regioni specifiche attraverso il tessuto per chiarire la biologia sottostante. Qui, lo studio dimostra che i protocolli di visualizzazione automatica degli anticorpi personalizzati possono essere utilizzati per guidare la selezione del ROI in combinazione con saggi di proteomica spaziale. Questo metodo specifico non ha mostrato prestazioni accettabili con saggi di trascrittomica spaziale. Il protocollo descrive lo sviluppo di un test immunofluorescente (IF) a 3 plessi per la visualizzazione dei marcatori su una piattaforma automatizzata, utilizzando l’amplificazione del segnale del tiramido (TSA) per amplificare il segnale fluorescente da un determinato bersaglio proteico e aumentare il pool di anticorpi tra cui scegliere. Il protocollo di visualizzazione è stato automatizzato utilizzando un test 3-plex accuratamente convalidato per garantire qualità e riproducibilità. Inoltre, è stato valutato lo scambio di DAPI per coloranti SYTO per consentire l’imaging di saggi IF basati su TSA sulla piattaforma di profilazione spaziale. Inoltre, abbiamo testato la capacità di selezionare piccoli ROI utilizzando il saggio di trascrittomica spaziale per consentire l’indagine di aree di interesse altamente specifiche (ad esempio, aree arricchite per un determinato tipo di cellula). Sono stati raccolti ROI di 50 μm e 300 μm di diametro, che corrispondono rispettivamente a circa 15 cellule e 100 celle. I campioni sono stati inseriti in librerie e sequenziati per studiare la capacità di rilevare segnali provenienti da piccoli ROI e regioni specifiche del profilo del tessuto. Abbiamo determinato che le tecnologie di proteomica spaziale traggono grande vantaggio da protocolli automatizzati e standardizzati per guidare la selezione del ROI. Sebbene questo protocollo di visualizzazione automatizzata non fosse compatibile con i saggi di trascrittomica spaziale, siamo stati in grado di testare e confermare che specifiche popolazioni cellulari possono essere rilevate con successo anche in piccoli ROI con il protocollo di visualizzazione manuale standard.
Introduction
I progressi nelle tecniche di multiplexing continuano a fornire migliori strumenti di caratterizzazione per i bersagli presenti nei tumori. Il microambiente tumorale (TME) è un sistema complesso di cellule tumorali, cellule immunitarie infiltranti e stroma, in cui le informazioni spaziali sono fondamentali per comprendere e interpretare meglio i meccanismi di interazione tra biomarcatori di interesse1. Con tecniche emergenti come GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e 10x Visium, è possibile rilevare e quantificare contemporaneamente più target all’interno del loro contesto spaziale. L’uso di protocolli di immunofluorescenza che facilitano la visualizzazione dei tessuti può migliorare ulteriormente le capacità di profilazione spaziale di queste tecnologie.
La tecnologia Spatial Omics su cui ci siamo concentrati per lo sviluppo di questo metodo consiste in saggi di proteomica spaziale e trascrittomica in cui gli oligonucleotidi sono attaccati ad anticorpi o sonde di RNA tramite un linker fotocliviale sensibile ai raggi UV. I vetrini istologici sono etichettati con questi anticorpi o sonde oligo-coniugati e quindi visualizzati sulla piattaforma di profilazione spaziale. Successivamente, vengono selezionati ROI di diverse dimensioni e forme per l’illuminazione e gli oligonucleotidi fotoscissi vengono aspirati e raccolti in una piastra da 96 pozzetti. Gli oligonucleotidi fotoscissi sono preparati per essere quantificati con il sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
Le distribuzioni cellulari variano all’interno dei tessuti e la capacità di caratterizzare posizioni specifiche delle cellule utilizzando marcatori selezionati e diverse dimensioni del ROI è di grande importanza per comprendere appieno l’ambiente tissutale e identificare caratteristiche specifiche. Nella tecnologia Spatial Omics qui menzionata, il protocollo di visualizzazione standard utilizza anticorpi coniugati direttamente ed è un protocollo manuale. I marcatori standard per distinguere tra tumore e stroma sono panCytokeratin (panCK) e CD456,7, ma sono necessari ulteriori marcatori per indirizzare specifiche popolazioni cellulari di interesse. Inoltre, l’uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati manca di amplificazione, il che limita la selezione degli anticorpi a marcatori abbondanti. Inoltre, i saggi manuali sono soggetti a una maggiore variabilità rispetto ai flussi di lavoro automatizzati8. Pertanto, è auspicabile disporre di un protocollo di visualizzazione personalizzabile, automatizzato e amplificato per la selezione del ROI.
Qui, lo studio dimostra che, per i saggi di proteomica spaziale, la tecnologia TSA può essere utilizzata per protocolli di visualizzazione su una piattaforma automatizzata con conseguente test più mirato e standardizzato. Inoltre, i saggi basati su TSA consentono l’uso di marcatori a bassa espressione, aumentando la gamma di obiettivi che possono essere selezionati per la visualizzazione. Un test 3-plex per panCK, FAP e Antibody X è stato sviluppato utilizzando una piattaforma automatizzata in cui panCK e FAP sono stati utilizzati per differenziare tra tumore e stroma, rispettivamente. L’anticorpo X è una proteina stromale frequentemente riscontrata nei tumori, ma la sua biologia e l’impatto sull’immunità antitumorale non sono completamente compresi. La caratterizzazione del contesto immunitario in aree ricche di anticorpi X può chiarire il suo ruolo nell’immunità antitumorale e nella risposta terapeutica, nonché il suo potenziale come bersaglio farmacologico.
Mentre i pannelli di visualizzazione automatizzati TSA personalizzati si sono dimostrati efficaci per i saggi di proteomica spaziale, l’applicazione di questi saggi per i saggi di trascrittomica spaziale non ha potuto essere confermata. Ciò è probabilmente dovuto ai reagenti e al protocollo utilizzato per i protocolli di visualizzazione automatica, che sembrano compromettere l’integrità dell’RNA. Riconoscere che un protocollo di etichettatura automatizzato per i marcatori di visualizzazione può essere utilizzato per i saggi di proteomica spaziale ma non per i saggi di trascrittomica spaziale fornisce importanti indicazioni sui progetti di analisi della tecnologia Spatial Omics.
Inoltre, lo studio dimostra che il saggio di trascrittomica spaziale può essere utilizzato per profilare bersagli in regioni di diametro fino a 50 μm o circa 15 cellule. Sono stati selezionati due ROI di dimensioni diverse per testare la capacità del test di rilevare anche trascrizioni in piccoli ROI. Per ogni regione di interesse, gli oligo corrispondenti a 1.800 bersagli di mRNA sono stati raccolti e trasformati in librerie secondo il protocollo della piattaforma di profilazione spaziale. Le librerie sono state indicizzate singolarmente, successivamente raggruppate e sequenziate. Ciò ha permesso di valutare sia l’efficienza del pooling che la capacità di identificare specifiche popolazioni cellulari in piccoli ROI.
Questo articolo mostra che per i saggi di proteomica spaziale, un protocollo automatizzato per guidare la selezione del ROI su specifici marcatori di interesse può essere utilizzato per indirizzare selettivamente l’interrogazione di aree tissutali rilevanti e caratterizzare l’ambiente spaziale del tessuto. Inoltre, dimostriamo che ROI più piccoli possono essere utilizzati per saggi trascrittomici spaziali per rilevare e caratterizzare specifiche popolazioni cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ad oggi, gli anticorpi fluorescenti direttamente coniugati in un protocollo manuale sono più comunemente usati come pannelli di visualizzazione per la proteomica spaziale o saggi di trascrittomica spaziale 9,10. Tuttavia, l’uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati può essere difficile per marcatori meno abbondanti, limitando la selezione di anticorpi adatti. Questo protocollo mostra che l’etichettatura dei marcatori di visualizzazione può essere au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono a Thomas Wu l’elaborazione dei file NGS. Ringraziamo James Ziai per le discussioni sui risultati e la revisione del manoscritto e Meredith Triplet e Rachel Taylor per la revisione interna del manoscritto.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
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