Пространственное профилирование экспрессии белка и РНК в тканях: подход к тонкой настройке виртуальной микродиссекции
Summary
Здесь мы описываем протокол для тонкой настройки областей интереса (ROI) для технологий пространственной омики, чтобы лучше охарактеризовать микроокружение опухоли и идентифицировать конкретные клеточные популяции. Для анализов протеомики автоматизированные настраиваемые протоколы могут направлять выбор ROI, в то время как анализы транскриптомики могут быть точно настроены с использованием ROI размером до 50 мкм.
Abstract
Мультиплексирование позволяет оценить несколько маркеров на одной и той же ткани, обеспечивая при этом пространственный контекст. Технологии пространственной омики позволяют мультиплексировать как белки, так и РНК, используя фоторасщепляемые олиго-помеченные антитела и зонды соответственно. Олиго расщепляются и количественно определяются из определенных областей по всей ткани, чтобы прояснить основную биологию. Здесь исследование показывает, что автоматизированные пользовательские протоколы визуализации антител могут быть использованы для управления выбором ROI в сочетании с пространственными протеомическими анализами. Этот специфический метод не показал приемлемой производительности с пространственными транскриптомическими анализами. Протокол описывает разработку 3-плексного иммунофлуоресцентного (ПЧ) анализа для визуализации маркеров на автоматизированной платформе с использованием амплификации тирамидного сигнала (TSA) для усиления флуоресцентного сигнала от заданной белковой мишени и увеличения пула антител на выбор. Протокол визуализации был автоматизирован с использованием тщательно проверенного 3-плексного анализа для обеспечения качества и воспроизводимости. Кроме того, был оценен обмен DAPI на красители SYTO, чтобы позволить визуализировать анализы ПЧ на основе TSA на платформе пространственного профилирования. Кроме того, мы проверили способность выбора небольших ROI с использованием пространственного транскриптомического анализа, чтобы позволить исследовать высокоспецифичные области, представляющие интерес (например, области, обогащенные для данного типа клеток). Были собраны ROI диаметром 50 мкм и 300 мкм, что соответствует примерно 15 клеткам и 100 клеткам соответственно. Образцы были собраны в библиотеки и секвенированы для изучения способности обнаруживать сигналы от небольших ROI и профильных областей ткани. Мы определили, что технологии пространственной протеомики извлекают большую выгоду из автоматизированных, стандартизированных протоколов для управления выбором ROI. Хотя этот автоматизированный протокол визуализации не был совместим с пространственными транскриптомическими анализами, мы смогли протестировать и подтвердить, что конкретные популяции клеток могут быть успешно обнаружены даже при небольших ROI со стандартным протоколом ручной визуализации.
Introduction
Достижения в методах мультиплексирования продолжают предоставлять лучшие инструменты характеристики для мишеней, присутствующих в опухолях. Микроокружение опухоли (TME) представляет собой сложную систему опухолевых клеток, инфильтрирующих иммунные клетки и стромы, где пространственная информация имеет решающее значение для лучшего понимания и интерпретации механизмов взаимодействия между биомаркерами, представляющими интерес1. С помощью новых методов, таких как GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) и 10x Visium, несколько целей могут быть обнаружены и количественно определены одновременно в их пространственном контексте. Использование протоколов иммунофлуоресценции, которые облегчают визуализацию тканей, может еще больше улучшить возможности пространственного профилирования этих технологий.
Технология пространственной омики, на которой мы сосредоточились для разработки этого метода, состоит из пространственной протеомики и транскриптомики, где олигонуклеотиды прикрепляются к антителам или РНК-зондам через УФ-чувствительный фоторасщепляющийся линкер. Гистологические слайды маркируются этими олигоконъюгированными антителами или зондами, а затем визуализируются на платформе пространственного профилирования. Далее для освещения подбираются ROИ разных размеров и форм, а фоторасщепленные олигонуклеотиды аспирируются и собираются в 96-луночную пластину. Фоторасщепленные олигонуклеотиды готовятся к количественной оценке либо с помощью системы Nanostring nCounter, либо с помощью секвенирования следующего поколения (NGS)2,3 (рисунок 1)4,5.
Распределение клеток варьируется внутри тканей, и способность характеризовать конкретные местоположения клеток с использованием выбранных маркеров и различных размеров ROI имеет большое значение для полного понимания тканевой среды и выявления конкретных особенностей. В технологии Spatial Omics, упомянутой здесь, стандартный протокол визуализации использует непосредственно сопряженные антитела и является ручным протоколом. Стандартными маркерами для различения опухоли и стромы являются панцитокератин (panCK) и CD45 6,7, но дополнительные маркеры необходимы для нацеливания на конкретные клеточные популяции, представляющие интерес. Кроме того, использование непосредственно конъюгированных флуоресцентных антител не сопровождается амплификацией, что ограничивает отбор антител обильными маркерами. Кроме того, ручные анализы подвержены большей изменчивости, чем автоматизированные рабочие процессы8. Поэтому желательно иметь настраиваемый, автоматизированный и усиленный протокол визуализации для выбора ROI.
Здесь исследование показывает, что для пространственных протеомических анализов технология TSA может использоваться для протоколов визуализации на автоматизированной платформе, что приводит к более целенаправленному и стандартизированному анализу. Кроме того, анализы на основе TSA позволяют использовать маркеры с низкой экспрессией, увеличивая диапазон целей, которые могут быть выбраны для визуализации. 3-плексный анализ для panCK, FAP и Antibody X был разработан с использованием автоматизированной платформы, где panCK и FAP использовались для дифференциации опухоли и стромы соответственно. Антитело X является стромальным белком, часто встречающимся в опухолях, но его биология и влияние на противоопухолевый иммунитет до конца не изучены. Характеристика иммунного контекста в областях, богатых антителом X, может прояснить его роль в противоопухолевом иммунитете и терапевтическом ответе, а также его потенциал в качестве лекарственной мишени.
В то время как индивидуальные автоматизированные панели визуализации TSA оказались успешными для пространственных протеомических анализов, применение этих анализов для пространственных транскриптомических анализов не может быть подтверждено. Это, скорее всего, связано с реагентами и протоколом, используемым для автоматизированных протоколов визуализации, которые, по-видимому, ставят под угрозу целостность РНК. Признание того, что автоматизированный протокол маркировки для маркеров визуализации может использоваться для пространственных протеомических анализов, но не для пространственных транскриптомических анализов, дает важное руководство по проектированию технологических анализов пространственной омики.
Кроме того, исследование показывает, что анализ пространственной транскриптомики может быть использован для профилирования целей в областях диаметром до 50 мкм или примерно 15 клеток. Были выбраны два ROI разного размера для проверки способности анализа также обнаруживать транскрипты в небольших ROI. Для каждой интересующей области олиго, соответствующие мишеням 1 800 мРНК, были собраны и превращены в библиотеки в соответствии с протоколом платформы пространственного профилирования. Библиотеки индексировались по отдельности, впоследствии объединялись в пул и секвенировались. Это позволило оценить как эффективность объединения, так и способность идентифицировать конкретные популяции клеток в небольших ROI.
В данной работе показано, что для пространственных протеомических анализов автоматизированный протокол для управления выбором ROI по конкретным маркерам, представляющим интерес, может быть использован для избирательного нацеливания на опрос соответствующих областей ткани и характеристики пространственной среды ткани. Кроме того, мы демонстрируем, что меньшие ROI могут быть использованы для пространственных транскриптомных анализов для обнаружения и характеристики конкретных клеточных популяций.
Protocol
Representative Results
Discussion
На сегодняшний день непосредственно сопряженные флуоресцентные антитела в ручном протоколе чаще всего используются в качестве панелей визуализации для пространственной протеомики или пространственных транскриптомических анализов 9,10. Однако использ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают Томаса Ву за обработку файлов NGS. Мы благодарим Джеймса Зиай за обсуждение результатов и рецензирование рукописей, а также Мередит Триплет и Рэйчел Тейлор за внутреннюю редакцию рукописи.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
