조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식
Summary
여기에서는 종양 미세 환경을 더 잘 특성화하고 특정 세포 집단을 식별하기 위해 Spatial Omics 기술의 관심 영역(ROI)을 미세 조정하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질체학 분석의 경우 자동화된 맞춤형 프로토콜이 ROI 선택을 안내할 수 있는 반면, 전사체학 분석은 50μm의 작은 ROI를 활용하여 미세 조정할 수 있습니다.
Abstract
멀티플렉싱을 사용하면 동일한 조직에서 여러 마커를 평가하는 동시에 공간적 맥락을 제공할 수 있습니다. Spatial Omics 기술은 각각 광절단 가능한 올리고 태그 항체와 프로브를 활용하여 단백질과 RNA 멀티플렉싱을 모두 가능하게 합니다. 올리고는 조직 전체의 특정 영역에서 절단되고 정량화되어 기본 생물학을 설명합니다. 여기에서 이 연구는 자동화된 맞춤형 항체 시각화 프로토콜을 활용하여 공간 단백질체학 분석과 함께 ROI 선택을 안내할 수 있음을 보여줍니다. 이 특정 방법은 공간 전사체학 분석에서 허용 가능한 성능을 나타내지 않았습니다. 이 프로토콜은 티라마이드 신호 증폭(TSA)을 사용하여 주어진 단백질 표적의 형광 신호를 증폭하고 선택할 수 있는 항체 풀을 늘리는 자동화된 플랫폼에서 마커 시각화를 위한 3-plex 면역형광(IF) 분석의 개발을 설명합니다. 시각화 프로토콜은 품질과 재현성을 보장하기 위해 철저히 검증된 3-plex 분석을 사용하여 자동화되었습니다. 또한 공간 프로파일링 플랫폼에서 TSA 기반 IF 분석의 이미징을 허용하도록 SYTO 염료에 대한 DAPI의 교환을 평가했습니다. 또한 공간 전사체학 분석을 사용하여 작은 ROI를 선택하여 매우 특정한 관심 영역(예: 주어진 세포 유형에 대해 풍부한 영역)을 조사할 수 있는 능력을 테스트했습니다. 50 μm 및 300 μm 직경의 ROI를 수집하였으며, 이는 각각 대략 15 개의 세포 및 100 개의 세포에 해당한다. 샘플을 라이브러리로 만들고 시퀀싱하여 조직의 작은 ROI 및 프로파일 특이적 영역에서 신호를 감지하는 기능을 조사했습니다. 우리는 공간 단백질체학 기술이 ROI 선택을 안내하는 자동화되고 표준화된 프로토콜의 이점을 크게 활용한다고 판단했습니다. 이 자동화된 시각화 프로토콜은 공간 전사체학 분석과 호환되지 않았지만 표준 수동 시각화 프로토콜을 사용하여 작은 ROI에서도 특정 세포 집단을 성공적으로 검출할 수 있는지 테스트하고 확인할 수 있었습니다.
Introduction
멀티플렉싱 기술의 발전은 종양에 존재하는 표적에 대해 더 나은 특성화 도구를 계속 제공합니다. 종양 미세환경(TME)은 종양 세포, 침윤 면역 세포 및 기질의 복잡한 시스템으로, 공간정보는 관심 바이오마커 간의 상호 작용 메커니즘을 더 잘 이해하고 해석하는 데 중요합니다1. GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP) 및 10x Visium과 같은 새로운 기술을 통해 공간 컨텍스트 내에서 여러 대상을 동시에 감지하고 정량화할 수 있습니다. 조직 시각화를 용이하게 하는 면역형광 프로토콜을 사용하면 이러한 기술의 공간 프로파일링 기능을 더욱 향상시킬 수 있습니다.
이 방법 개발을 위해 집중한 Spatial Omics 기술은 UV 민감성 광절단 링커를 통해 올리고뉴클레오티드가 항체 또는 RNA 프로브에 부착되는 공간 단백질체학 및 전사체학 분석으로 구성됩니다. 조직학적 슬라이드는 이러한 올리고-접합된 항체 또는 프로브로 표지된 다음 공간 프로파일링 플랫폼에서 이미지화됩니다. 다음으로, 조명을 위해 다양한 크기와 모양의 ROI를 선택하고, 광절단된 올리고뉴클레오티드를 흡인하여 96웰 플레이트에 수집합니다. 광절단 올리고뉴클레오티드는 나노스트링 nCounter 시스템 또는 차세대 염기서열분석(NGS)2,3(그림 1)4,5로 정량할 수 있도록 준비됩니다.
세포 분포는 조직 내에서 다양하며, 선택된 마커와 다양한 ROI 크기를 사용하여 세포의 특정 위치를 특성화하는 능력은 조직 환경을 완전히 이해하고 특정 특징을 식별하는 데 매우 중요합니다. 여기에 언급된 Spatial Omics 기술에서 표준 시각화 프로토콜은 직접 접합 항체를 사용하며 수동 프로토콜입니다. 종양과 기질을 구별하는 표준 마커는 panCytokeratin (panCK) 및 CD45 6,7이지만 관심있는 특정 세포 집단을 표적으로 삼기 위해서는 추가 마커가 필요합니다. 또한, 직접 접합된 형광 항체의 사용은 증폭이 부족하여 항체 선택을 풍부한 마커로 제한합니다. 또한 수동 분석은 자동화된 워크플로우보다 더 가변성이 있습니다8. 따라서, ROI 선택을 위한 커스터마이징, 자동화 및 증폭된 시각화 프로토콜을 갖는 것이 바람직하다.
여기에서 이 연구는 공간 단백질체학 분석의 경우 TSA 기술을 자동화된 플랫폼의 시각화 프로토콜에 사용하여 보다 표적화되고 표준화된 분석을 수행할 수 있음을 보여줍니다. 또한 TSA 기반 분석을 통해 저발현 마커를 사용할 수 있으므로 시각화를 위해 선택할 수 있는 표적의 범위가 늘어납니다. panCK, FAP 및 항체 X에 대한 3-plex 분석은 panCK 및 FAP를 사용하여 각각 종양과 기질을 구별하는 자동화 플랫폼을 사용하여 개발되었습니다. 항체 X는 종양에서 자주 발생하는 기질 단백질이지만 생물학과 항 종양 면역에 미치는 영향은 완전히 이해되지 않았습니다. 항체 X가 풍부한 영역에서 면역 질감을 특성화하면 항 종양 면역 및 치료 반응에서의 역할과 약물 표적으로서의 잠재력을 설명 할 수 있습니다.
맞춤형 자동 TSA 시각화 패널이 공간 단백질체학 분석에 성공한 것으로 입증되었지만 공간 전사체학 분석에 대한 이러한 분석의 적용은 확인할 수 없었습니다. 이는 RNA 무결성을 손상시키는 것으로 보이는 자동화된 시각화 프로토콜에 사용되는 시약과 프로토콜 때문일 가능성이 큽니다. 시각화 마커에 대한 자동 라벨링 프로토콜은 공간 단백질체학 분석에는 사용할 수 있지만 공간 전사체학 분석에는 사용할 수 없다는 사실을 인식하면 공간 오믹스 기술 분석 설계에 대한 중요한 지침을 제공합니다.
또한이 연구는 공간 전사체학 분석을 사용하여 직경이 50μm만큼 작은 영역 또는 약 15 개의 세포에서 표적을 프로파일 링 할 수 있음을 보여줍니다. 작은 ROI에서 전사체를 검출하는 분석의 능력을 테스트하기 위해 두 가지 다른 크기의 ROI가 선택되었습니다. 각 관심 영역에 대해 1,800개의 mRNA 표적에 해당하는 올리고를 수집하여 공간 프로파일링 플랫폼 프로토콜에 따라 라이브러리로 만들었습니다. 라이브러리는 개별적으로 인덱싱되고, 이후에 풀링되고, 순서가 지정되었습니다. 이를 통해 풀링 효율성과 작은 ROI에서 특정 세포 집단을 식별하는 능력을 모두 평가할 수 있었습니다.
이 논문은 공간 단백질체학 분석의 경우 관심 있는 특정 마커에 대한 ROI 선택을 안내하는 자동화된 프로토콜을 사용하여 관련 조직 영역의 질문을 선택적으로 타겟팅하고 조직의 공간 환경을 특성화할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 특정 세포 집단을 검출하고 특성화하기 위한 공간 전사체 분석에 더 작은 ROI를 사용할 수 있음을 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재까지, 수동 프로토콜에서 직접 접합된 형광 항체는 공간 단백질체학 또는 공간 전사체학 분석(9,10)을 위한 시각화 패널로서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 직접 접합된 형광 항체의 사용은 덜 풍부한 마커에 대해 도전적일 수 있으며, 적합한 항체의 선택을 제한할 수 있다. 이 프로토콜은 공간 단백질체학 분석을 지원하기 위해 TSA 기술을 사용?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 NGS 파일을 처리 한 Thomas Wu를 인정합니다. 결과 토론과 원고 검토에 대해 James Ziai와 내부 원고 수정을 위해 Meredith Triplet과 Rachel Taylor에게 감사드립니다.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
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