Romlig profilering av protein- og RNA-uttrykk i vev: En tilnærming til finjustering av virtuell mikrodisseksjon

Summary

Her beskriver vi en protokoll for finjustering av interesseområder (ROIs) for Spatial Omics-teknologier for bedre å karakterisere tumormikromiljøet og identifisere spesifikke cellepopulasjoner. For proteomikkanalyser kan automatiserte tilpassede protokoller veilede avkastningsvalg, mens transkriptomikkanalyser kan finjusteres ved å bruke avkastninger så små som 50 μm.

Abstract

Multiplexing gjør det mulig å vurdere flere markører på samme vev samtidig som det gir romlig kontekst. Romlige Omics-teknologier tillater både protein- og RNA-multipleksing ved å utnytte henholdsvis fotospaltbare oligo-merkede antistoffer og prober. Oligoer spaltes og kvantifiseres fra bestemte regioner over vevet for å belyse den underliggende biologien. Her viser studien at automatiserte tilpassede antistoffvisualiseringsprotokoller kan brukes til å veilede avkastningsvalg i forbindelse med romlige proteomikkanalyser. Denne spesifikke metoden viste ikke akseptabel ytelse med romlige transkriptomikkanalyser. Protokollen beskriver utviklingen av en 3-plex immunfluorescerende (IF) analyse for markørvisualisering på en automatisert plattform, ved hjelp av tyramidsignalforsterkning (TSA) for å forsterke fluorescerende signal fra et gitt proteinmål og øke antistoffbassenget å velge mellom. Visualiseringsprotokollen ble automatisert ved hjelp av en grundig validert 3-plex analyse for å sikre kvalitet og reproduserbarhet. I tillegg ble utvekslingen av DAPI for SYTO-fargestoffer evaluert for å tillate avbildning av TSA-baserte IF-analyser på den romlige profileringsplattformen. I tillegg testet vi muligheten til å velge små avkastninger ved hjelp av spatial transcriptomics-analysen for å tillate undersøkelse av svært spesifikke interesseområder (f.eks. Områder beriket for en gitt celletype). ROI på 50 μm og 300 μm diameter ble samlet, noe som tilsvarer henholdsvis ca. 15 celler og 100 celler. Prøver ble laget i biblioteker og sekvensert for å undersøke evnen til å oppdage signaler fra små avkastninger og profilspesifikke regioner i vevet. Vi bestemte oss for at romlige proteomikkteknologier drar stor nytte av automatiserte, standardiserte protokoller for å veilede avkastningsvalg. Selv om denne automatiserte visualiseringsprotokollen ikke var kompatibel med romlige transkriptomikkanalyser, var vi i stand til å teste og bekrefte at spesifikke cellepopulasjoner med hell kan oppdages selv i små avkastninger med standard manuell visualiseringsprotokoll.

Introduction

Fremskritt i multipleksingsteknikker fortsetter å gi bedre karakteriseringsverktøy for mål som er tilstede i svulster. Tumormikromiljøet (TME) er et komplekst system av tumorceller, infiltrerende immunceller og stroma, hvor romlig informasjon er avgjørende for å bedre forstå og tolke mekanismer for interaksjon mellom biomarkører av interesse¹. Med nye teknikker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) og 10x Visium, kan flere mål oppdages og kvantifiseres samtidig innenfor deres romlige kontekst. Bruken av immunfluorescensprotokoller som letter vevsvisualisering, kan ytterligere forbedre de romlige profileringsegenskapene til disse teknologiene.

Spatial Omics-teknologien vi fokuserte på for denne metodeutviklingen består av romlige proteomikk- og transkriptomikkanalyser der oligonukleotider er festet til antistoffer eller RNA-sonder via en UV-sensitiv fotoklyvbar linker. Histologiske lysbilder er merket med disse oligo-konjugerte antistoffene eller sondene og deretter avbildet på den romlige profileringsplattformen. Deretter velges avkastninger av forskjellige størrelser og former for belysning, og de fotokleaved oligonukleotidene aspireres og samles i en 96-brønns plate. De fotokleaved oligonukleotidene er forberedt på å bli kvantifisert med enten Nanostring nCounter-systemet eller Next Generation Sequencing (NGS) ^2,3 (Figur 1) ^4,5.

Cellefordelinger varierer innenfor vev, og evnen til å karakterisere bestemte steder av celler ved hjelp av utvalgte markører og forskjellige avkastningsstørrelser er av stor betydning for å forstå vevsmiljøet fullt ut og identifisere spesifikke funksjoner. I Spatial Omics-teknologien som er nevnt her, bruker standard visualiseringsprotokoll direkte konjugerte antistoffer og er en manuell protokoll. Standardmarkørene for å skille mellom tumor og stroma er panCytokeratin (panCK) og CD45^6,7, men ytterligere markører er nødvendige for å målrette mot spesifikke cellepopulasjoner av interesse. Videre mangler bruk av direkte konjugerte fluorescerende antistoffer forsterkning, noe som begrenser antistoffvalg til rikelig markører. I tillegg er manuelle analyser gjenstand for større variasjon enn automatiserte arbeidsflyter⁸. Derfor er det ønskelig å ha en tilpassbar, automatisert og forsterket visualiseringsprotokoll for valg av avkastning.

Her viser studien at TSA-teknologi for romlige proteomikkanalyser kan brukes til visualiseringsprotokoller på en automatisert plattform, noe som resulterer i en mer målrettet og standardisert analyse. I tillegg muliggjør TSA-baserte analyser bruk av markører med lav uttrykk, noe som øker rekkevidden av mål som kan velges for visualisering. En 3-plex analyse for panCK, FAP og antistoff X ble utviklet ved hjelp av en automatisert plattform der panCK og FAP ble brukt til å skille mellom henholdsvis tumor og stroma. Antistoff X er et stromalt protein som ofte oppstår i svulster, men dets biologi og innvirkning på antitumorimmunitet er ikke fullt ut forstått. Karakterisering av immunkontexture i områder rik på antistoff X kan belyse sin rolle i antitumorimmunitet og terapeutisk respons, samt potensialet som et legemiddelmål.

Mens tilpassede automatiserte TSA-visualiseringspaneler viste seg å være vellykkede for romlige proteomikkanalyser, kunne anvendelsen av disse analysene for romlige transkriptomikkanalyser ikke bekreftes. Dette skyldes mest sannsynlig reagensene og protokollen som brukes til de automatiserte visualiseringsprotokollene, som ser ut til å kompromittere RNA-integriteten. Erkjennelsen av at en automatisert merkingsprotokoll for visualiseringsmarkører kan brukes til romlige proteomikkanalyser, men ikke for romlige transkriptomikkanalyser, gir viktig veiledning om Spatial Omics teknologianalysedesign.

I tillegg viser studien at den romlige transkriptomikkanalysen kan brukes til å profilere mål i regioner så små som 50 μm i diameter, eller omtrent 15 celler. To ROIer i forskjellige størrelser ble valgt for å teste analysens evne til også å oppdage transkripsjoner i små avkastninger. For hver interesseregion ble oligoer tilsvarende 1,800 mRNA-mål samlet og gjort til biblioteker i henhold til den romlige profileringsplattformprotokollen. Biblioteker ble individuelt indeksert, deretter samlet og sekvensert. Dette tillot evalueringen av både pooling effektivitet og evnen til å identifisere spesifikke cellepopulasjoner i små avkastninger.

Dette papiret viser at for romlige proteomikkanalyser kan en automatisert protokoll for å veilede avkastningsvalg på spesifikke markører av interesse brukes til selektivt å målrette avhør av relevante vevsområder og karakterisere vevets romlige miljø. Videre demonstrerer vi at mindre avkastninger kan brukes til romlige transkriptomiske analyser for å oppdage og karakterisere spesifikke cellepopulasjoner.

Protocol

Alt menneskelig vev ble anskaffet fra kommersielle biobanker eller akkrediterte vevsbanker under garanti for at passende godkjenning fra Institutional Review Board og informert samtykke ble innhentet. MERK: Protokollen utføres ved hjelp av Discovery Ultra og GeoMx Digital Spatial Profiler. Se materialtabellen for detaljer om reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen. 1. Automatisert visualiseringsprotokoll for romlige pr…

Representative Results

Automatisert visualiseringsprotokoll for å veilede valg av avkastningI dette papiret presenterer vi bruken av en automatisert, tilpasset TSA-basert IF-protokoll for å visualisere vevet og velge spesifikke avkastninger. Visualiseringspanelutvikling ved bruk av melanom og menneskelig normal hud som kontrollvev besto av epitopstabilitetstesting, finjustering av markørintensiteter og blødningsvurdering gjennom la en ut kontroller. For å teste om epitopstabiliteten til antistoffene påvirkes av repet…

Discussion

Til dags dato er direkte konjugerte fluorescerende antistoffer i en manuell protokoll mest brukt som visualiseringspaneler for romlig proteomikk eller romlige transkriptomikkanalyser ^9,10. Imidlertid kan bruk av direkte konjugerte fluorescerende antistoffer være utfordrende for mindre rikelige markører, noe som begrenser valget av egnede antistoffer. Denne protokollen viser at merking av visualiseringsmarkører kan automatiseres på en automatisert fargeplattfo…

Materials

10x Tris buffered saline (TBS)	Cell Signaling Technologies	12498S	Diluted to 1x TBS in DEPC treated water
Antibody X (not disclosed)			antibody blinded due to confidentiality
DEPC-treated water	ThermoFisher	AM9922	Another can be used
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)	Ventana	950-500
DISCOVERY Cy5 Kit	Ventana	760-238	Referred as Cy5
DISCOVERY FAM Kit	Ventana	760-243	Referred as FAM
DISCOVERY Goat Ig Block	Ventana	760-6008	Referred as Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP	Ventana	760-4310	Referred as OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP	Ventana	760-4311	Referred as OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit	Ventana	760-244	Referred as Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System	Ventana	05 987 750 001 / N750-DISU-FS	Referred as autostainer on the manuscript
FAP [EPR20021] Antibody	Abcam	Ab207178
GeoMx Digital Spatial Profiler	NanoString	GMX-DSP-1Y	Referred as spatial profiling platform on the manuscript
Humidity chamber	Simport	M920-2	Another can be used
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody	Abcam	Ab27988
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Python	Python		Statistical analysis
Reaction Buffer (10x)	Ventana	950-300
Statistical analysis software	GraphPad	Prism 7	Statistical analysis
SYTO 64	ThermoFisher	S11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)	Ventana	950-223
Ventana Antibody Diluent with Casein	Ventana	760-219	Referred as specified diluent on the manuscript
Ventana Primary antibody dispenser	Ventana		Catalog number depends on dispenser number