Visualisering af membranflæsedannelse ved hjælp af scanningselektronmikroskopi

Summary

Makropinocytose er en stærkt bevaret endocytisk proces initieret ved dannelsen af F-actinrige arklignende membranfremspring, også kendt som membranflæser. Øget hastighed af makropinocytotisk solind internalisering har været impliceret i forskellige patologiske tilstande. Denne protokol præsenterer en metode til at kvantificere membranflæsedannelse in vitro ved hjælp af scanningselektronmikroskopi.

Abstract

Membranruffling er dannelsen af bevægelige plasmamembranfremspring indeholdende et meshwork af nyligt polymeriserede actinfilamenter. Membranflæser kan dannes spontant eller som reaktion på vækstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbolestere. Nogle af membranfremspringene kan omorganisere sig i cirkulære membranflæser, der smelter sammen ved deres distale margener og danner kopper, der lukker og adskiller sig i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kaldet makropinosomer. Under processen fælder flæser ekstracellulær væske og opløste stoffer, der internaliserer i makropinosomer. Højopløselig scanningselektronmikroskopi (SEM) er en almindeligt anvendt billeddannelsesteknik til at visualisere og kvantificere membranflæsedannelse, cirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverfladen. Følgende protokol beskriver cellekulturbetingelserne, stimulering af membranflæsedannelsen in vitro, og hvordan man fikserer, dehydrerer og forbereder celler til billeddannelse ved hjælp af SEM. Kvantificering af membranruffling, datanormalisering og stimulatorer og hæmmere af membranflæsedannelse er også beskrevet. Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om makropinocytoseens rolle i fysiologiske og patologiske processer, undersøge nye mål, der regulerer dannelsen af membranflæser, og identificere endnu ukarakteriserede fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hæmmere af makropinocytose.

Introduction

Makropinocytose er en endocytisk proces, der er ansvarlig for internalisering af en stor mængde ekstracellulær væske og dens indhold via dannelsen af dynamiske og aktindrevne plasmamembranfremspring kaldet membranflæser¹. Mange af disse membranflæser danner kopper, der lukker og smelter tilbage på cellen og adskilles fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer, også kendt som makropinosomer¹. Selvom makropinocytose induceres af vækstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vækstfaktor (EGF) i en lang række celletyper, er der også observeret en yderligere unik, calciumafhængig proces kendt som konstitutiv makropinocytose i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.

Cellernes evne til at internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist sig at spille en vigtig rolle i en række fysiologiske processer, der spænder fra næringsoptagelse til patogenfangst og antigenpræsentation ^9,10,11. Men fordi denne proces er ikke-selektiv og inducerbar, har den også været impliceret i en række patologiske tilstande. Faktisk foreslog tidligere undersøgelser, at makropinocytose spiller en vigtig rolle i Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, kræft, nefrolitose og aterosklerose 12,13,14,15,16. Desuden har visse bakterier og vira vist sig at udnytte makropinocytose til at få adgang til værtsceller og fremkalde infektion ^17,18. Interessant nok kan stimulering af makropinocytose også udnyttes til målrettet levering af terapeutiske midler under forskellige sygdomstilstande ^19,20.

Tidligere undersøgelser har undersøgt makropinocytose ved at kvantificere internaliserede fluorescerende mærkede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse af farmakologiske midler, der hæmmer makropinocytose ved hjælp af flowcytometri og konfokal billeddannelse^21,22. Aktuelt tilgængelige farmakologiske værktøjer, der hæmmer makropinocytose, er begrænset til og består af 1) actinpolymerisationshæmmere (cytochalasin D og latrunculiner), 2) PI3K-blokkere (LY-290042 og wortmannin) og 3) hæmmere af natriumhydrogenbyttere (NHE) (amilocid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse hæmmere har endocytose uafhængige virkninger, er det vanskeligt selektivt at bestemme makropinocytose bidrag til opløst optagelse og sygdomspatogenese, især in vivo²¹.

Scanning elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop, der producerer ultrahøjopløselige billeder af celler ved hjælp af en fokuseret stråle af elektroner²⁶. I makropinocytoseforskning betragtes SEM-billeddannelse som guldstandardteknikken til at visualisere topografiske og morfologiske egenskaber ved plasmamembranen, kvantificere membranflæsedannelse og undersøge deres progression mod makropinosominternalisering. Desuden giver scanningselektronmikroskopi kombineret med kvantificering af opløst stofoptagelse i nærvær og fravær af makropinocytoseblokkere en pålidelig strategi til undersøgelse af makropinocytotisk solintualisering in vitro. Dette papir giver en detaljeret protokol om, hvordan man forbereder celler til SEM, visualiserer celleoverfladen, kvantificerer flæsedannelse og undersøger deres fremskridt mod koplukning og makropinosominternalisering.

Protocol

BEMÆRK: Følgende er en generel protokol, der bruges til at kvantificere membranflæsedannelse i RAW 264.7 makrofager ved hjælp af SEM-mikroskopi. Optimering kan være påkrævet for forskellige celletyper. 1. Cellelinje og cellekultur Dyrk RAW 264,7 makrofager i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% (vol/vol) varmeinaktiveret føtal bovin serum (FBS), 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Udskif…

Representative Results

Her beskriver vi resultaterne fra den præsenterede teknik. Repræsentative SEM-billeder vist i figur 1 viser dannelse af membranflæser i RAW 264.7 makrofager efter behandling med PMA og M-CSF. Billeder blev først taget ved en forstørrelse på 3.500x til kvantificeringsformål og derefter ved højere forstørrelsesniveauer (8.500x til 16.000x) for at vise plasmamembranen ved større detaljer. Forbehandling af makrofager med makropinocytosehæmmeren EIPA-svækket membranflæsedannelse (<st…

Discussion

Den nuværende SEM-billeddannelsesprotokol giver et værktøj til at visualisere og kvantificere membranflæsedannelse, cirkulære fremspring og makropinocytiske kopper på celleoverfladen in vitro. Selvom den nuværende protokol fokuserer på makrofager, har undersøgelser vist, at membranflæsedannelse også forekommer på forskellige andre celletyper, herunder dendritiske celler, fibroblaster, neuroner og kræftceller 11,12,14,21,30.<sup cl…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope