स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर झिल्ली रफल गठन visualizing
Summary
मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक अत्यधिक संरक्षित एंडोसाइटिक प्रक्रिया है जो एफ-एक्टिन-समृद्ध शीट-जैसे झिल्ली अनुमानों के गठन से शुरू होती है, जिसे झिल्ली रफल्स के रूप में भी जाना जाता है। मैक्रोपिनोसाइटोटिक विलेय आंतरिककरण की बढ़ी हुई दर को विभिन्न रोग स्थितियों में फंसाया गया है। यह प्रोटोकॉल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विट्रो में झिल्ली रफल गठन को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
झिल्ली रफलिंग गतिशील प्लाज्मा झिल्ली प्रोट्रूशियंस का गठन है जिसमें नए पॉलिमराइज्ड एक्टिन फिलामेंट्स का एक जालवर्क होता है। झिल्ली रफल्स अनायास या विकास कारकों, भड़काऊ साइटोकिन्स और फोरबोल एस्टर के जवाब में बन सकते हैं। कुछ झिल्ली प्रोट्रूशन परिपत्र झिल्ली रफल्स में पुनर्गठित हो सकते हैं जो उनके डिस्टल मार्जिन पर फ्यूज होते हैं और ऐसे कप बनाते हैं जो साइटोप्लाज्म में बड़े, विषम रिक्तिकाओं के रूप में बंद और अलग होते हैं जिन्हें मैक्रोपिनोसोम कहा जाता है। प्रक्रिया के दौरान, रफल्स एक्स्ट्रासेल्युलर तरल पदार्थ और विलेय को फंसाते हैं जो मैक्रोपिनोसोम के भीतर आंतरिक होते हैं। उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक आमतौर पर उपयोग की जाने वाली इमेजिंग तकनीक है जो कोशिका की सतह पर झिल्ली रफल गठन, परिपत्र प्रोट्रूशियंस और बंद मैक्रोपिनोसाइटिक कप की कल्पना और मात्रा निर्धारित करती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सेल संस्कृति की स्थिति, विट्रो में झिल्ली रफल गठन की उत्तेजना, और SEM का उपयोग करके इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को कैसे ठीक करें, निर्जलित करें, और तैयार करें। झिल्ली रफलिंग, डेटा सामान्यीकरण, और उत्तेजक और झिल्ली रफल गठन के अवरोधकों का परिमाणीकरण भी वर्णित है। यह विधि शारीरिक और रोग संबंधी प्रक्रियाओं में मैक्रोपिनोसाइटोसिस की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, नए लक्ष्यों की जांच कर सकती है जो झिल्ली रफल गठन को विनियमित करते हैं, और अभी तक अज्ञात शारीरिक उत्तेजकों के साथ-साथ मैक्रोपिनोसाइटोसिस के उपन्यास औषधीय अवरोधकों की पहचान करते हैं।
Introduction
Macropinocytosis एक एंडोसाइटिक प्रक्रिया है जो गतिशील और एक्टिन-संचालित प्लाज्मा झिल्ली प्रोट्रूशियंस के गठन के माध्यम से बड़ी मात्रा में बाह्य कोशिकीय तरल पदार्थ और इसकी सामग्री को आंतरिक बनाने के लिए जिम्मेदार है जिसे झिल्ली रफल्स1 कहा जाता है। इनमें से कई झिल्ली रफल्स कप बनाते हैं जो सेल पर वापस बंद और फ्यूज करते हैं और प्लाज्मा झिल्ली से बड़े, विषम इंट्रासेल्युलर एंडोसोम के रूप में अलग होते हैं जिन्हें मैक्रोपिनोसोम1 के रूप में भी जाना जाता है। यद्यपि मैक्रोपिनोसाइटोसिस कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) जैसे विकास कारकों से प्रेरित होता है, एक अतिरिक्त अद्वितीय, कैल्शियम-निर्भर प्रक्रिया जिसे संरचनात्मक मैक्रोपिनोसाइटोसिस के रूप में जाना जाता है, को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं 2,3,4,5,6,7,8 में भी देखा गया है।
मैक्रोपिनोसाइटोसिस के माध्यम से बाह्य कोशिकीय सामग्री को आंतरिक बनाने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जिसमें पोषक तत्वों के उत्थान से लेकर रोगज़नक़ कैप्चर और एंटीजन प्रस्तुति 9,10,11 तक शामिल हैं। हालांकि, क्योंकि यह प्रक्रिया गैर-चयनात्मक और अपरिवर्तनीय है, इसलिए इसे कई रोग स्थितियों में भी फंसाया गया है। दरअसल, पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया कि मैक्रोपिनोसाइटोसिस अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, कैंसर, नेफ्रोलिथियासिस और एथेरोस्क्लेरोसिस 12,13,14,15,16 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, कुछ बैक्टीरिया और वायरस ने मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश करने और संक्रमण को प्रेरित करने के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस का उपयोग करने और17,18 संक्रमण को प्रेरित करने के लिए दिखाया है। दिलचस्प बात यह है कि मैक्रोपिनोसाइटोसिस की उत्तेजना का भी विभिन्न रोग स्थितियों में चिकित्सीय एजेंटों के लक्षित वितरण के लिए शोषण किया जा सकताहै 19,20।
पिछले अध्ययनों ने फार्माकोलॉजिकल एजेंटों की अनुपस्थिति और उपस्थिति में आंतरिक फ्लोरोसेंट-टैग किए गए द्रव-चरण मार्करों को परिमाणित करके मैक्रोपिनोसाइटोसिस का पता लगाया है जो प्रवाह साइटोमेट्री और कॉन्फोकल इमेजिंग21,22 का उपयोग करके मैक्रोपिनोसाइटोसिस को रोकते हैं। वर्तमान में उपलब्ध औषधीय उपकरण जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस को रोकते हैं, वे सीमित हैं और इसमें 1) एक्टिन पोलीमराइजेशन इनहिबिटर (साइटोकैलासिन डी और लैट्रुनक्यूलिन), 2) पीआई3के ब्लॉकर्स (एलवाई -290042 और वोर्टमैनिन) और 3) सोडियम हाइड्रोजन एक्सचेंजर्स (एनएचई) (एमिलोराइड और ईआईपीए) के अवरोधक 5,14,15,23,24,25 शामिल हैं। . हालांकि, क्योंकि इन अवरोधकों में एंडोसाइटोसिस स्वतंत्र प्रभाव होते हैं, इसलिए विशेष रूप से विवो21 में विलेय अपटेक और रोग रोगजनन के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस के योगदान को चुनिंदा रूप से निर्धारित करना मुश्किल है।
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक प्रकार का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप है जो इलेक्ट्रॉनों के केंद्रित बीम का उपयोग करके कोशिकाओं की अल्ट्रा-उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करताहै। मैक्रोपिनोसाइटोसिस अनुसंधान में, एसईएम इमेजिंग को प्लाज्मा झिल्ली की स्थलाकृतिक और रूपात्मक विशेषताओं की कल्पना करने, झिल्ली रफल गठन को मापने और मैक्रोपिनोसोम आंतरिककरण की ओर उनकी प्रगति की जांच करने के लिए सोने की मानक तकनीक के रूप में माना जाता है। इसके अलावा, मैक्रोपिनोसाइटोसिस ब्लॉकर्स की उपस्थिति और अनुपस्थिति में विलेय अपटेक के परिमाणीकरण के साथ संयुक्त स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, विट्रो में मैक्रोपिनोसाइटोटिक विलेय आंतरिककरण की जांच करने के लिए एक विश्वसनीय रणनीति प्रदान करती है। यह पेपर SEM के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, सेल की सतह की कल्पना करता है, रफल गठन को मापता है, और कप बंद करने और मैक्रोपिनोसोम आंतरिककरण की दिशा में उनकी प्रगति की जांच करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान SEM इमेजिंग प्रोटोकॉल विट्रो में सेल सतह पर झिल्ली रफल गठन, परिपत्र प्रोट्रूशन, और मैक्रोपिनोसाइटिक कप की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यद्यपि वर्तमान प्रो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने लिब्बी पेरी (ऑगस्टा विश्वविद्यालय) को SEM नमूना तैयारी के साथ उसकी मदद के लिए धन्यवाद दिया। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01HL139562 (G.C.) और K99HL146954 (B.S.)] और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन [17POST33661254 (B.S.)] द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | |||
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