2D og 3D humant inducerede pluripotente stamcellebaserede modeller til at dissekere primær ciliuminddragelse under neokortikal udvikling
Summary
Vi præsenterer detaljerede protokoller til generering og karakterisering af 2D og 3D humant induceret pluripotent stamcelle (hIPSC) -baserede modeller for neokortikal udvikling samt komplementære metoder, der muliggør kvalitativ og kvantitativ analyse af primær cilium (PC) biogenese og funktion.
Abstract
Primære cilier (PC) er ikke-bevægelige dynamiske mikrotubulibaserede organeller, der stikker ud fra overfladen af de fleste pattedyrceller. De kommer ud af den ældre centriole under G1 / G0-fasen af cellecyklussen, mens de adskilles, når cellerne igen kommer ind i cellecyklussen ved G2 / M-fasegrænsen. De fungerer som signalhubs ved at detektere og transducere ekstracellulære signaler, der er afgørende for mange celleprocesser. I lighed med de fleste celletyper har alle neokortikale neurale stamceller og stamceller (NSPC’er) vist sig at have en pc, der giver dem mulighed for at fornemme og transducere specifikke signaler, der kræves til den normale cerebrale kortikale udvikling. Her leverer vi detaljerede protokoller til at generere og karakterisere todimensionelle (2D) og tredimensionelle (3D) cellebaserede modeller fra humane inducerede pluripotente stamceller (hIPSC’er) for yderligere at dissekere inddragelsen af pc under neokortikal udvikling. Især præsenterer vi protokoller til at studere pc-biogenesen og funktionen i 2D-neurale rosetafledte NSPC’er, herunder transduktion af Sonic Hedgehog (SHH) -vejen. For at drage fordel af den tredimensionelle (3D) organisation af cerebrale organoider beskriver vi en simpel metode til 3D-billeddannelse af in toto immunplettede cerebrale organoider. Efter optisk clearing muliggør hurtig erhvervelse af hele organoider påvisning af både centrosomer og pc på neokortikale forfædre og neuroner af hele organoidet. Endelig beskriver vi proceduren for immunsåbning og rydning af tykke fritsvævende organoidsektioner, der bevarer en betydelig grad af 3D-rumlig information og muliggør den højopløsningsopsamling, der kræves til detaljeret kvalitativ og kvantitativ analyse af pc-biogenese og funktion.
Introduction
Primære cilier (PC) er mikrotubuli-baserede organeller, der sanser og transducer en overflod af kemiske og mekaniske signaler fra det ekstracellulære miljø. PC er især den centrale organel til transduktion af pindsvinesignalvejen hos hvirveldyr1,2. Mens de fleste neurale celler længe har vist sig at have en pc, har denne organels bidrag til at forme centralnervesystemet længe været undervurderet. Undersøgelser af neokortikal udvikling har ført til opdagelsen af flere neurale stam- og stamceller (NSPC’er), der alle har en pc, hvis placering er blevet foreslået at være afgørende for bestemmelse af stamfaderskæbne3,4,5,6,7. PC har vist sig afgørende for cellemekanismer, der er nødvendige for normal cerebral kortikal udvikling, herunder NSPC-ekspansion og engagement8,9,10,11,12 samt apicobasal polaritet af radialt glialstillads, der understøtter neuronal migration13. Derudover kræves pc under interneuroner tangentiel migration til den kortikale plade14,15. Endelig er der foreslået en rolle for pc’en i etableringen af synaptiske forbindelser af neuroner i hjernebarken16,17. Alt i alt argumenterer disse resultater for en afgørende rolle for PC på store trin i cerebral kortikal udvikling18,19 og rejser behovet for at undersøge deres involvering i de patologiske mekanismer, der ligger til grund for anomalier i cerebral kortikal udvikling.
Nylige undersøgelser har i vid udstrækning forbedret vores forståelse af vigtige cellulære og molekylære forskelle mellem kortikal udvikling i humane og dyremodeller, hvilket understreger behovet for at udvikle menneskelige modelsystemer. Efter denne opfattelse repræsenterer humane inducerede pluripotente stamceller (hIPSC’er) en lovende tilgang til at studere sygdomspatogenese i en relevant genetisk og cellulær sammenhæng. Vedhæftende todimensionelle (2D) cellebaserede modeller eller neurale rosetter indeholder NSPC’er svarende til dem, der ses i den udviklende hjernebark, som bliver organiseret i rosetformede strukturer, der viser korrekt apicobasal polaritet20,21,22. Desuden tillader det tredimensionelle (3D) kultursystem generering af dorsale forhjerneorganoider, der rekapitulerer mange træk ved menneskelig cerebral kortikal udvikling23,24,25,26. Disse to komplementære cellebaserede modelleringsmetoder tilbyder spændende perspektiver til at dissekere inddragelsen af pc under normal og patologisk udvikling af hjernebarken.
Her giver vi detaljerede protokoller til generering og karakterisering af neurale rosetter og afledte NSPC’er samt dorsale forhjerneorganoider. Vi leverer også detaljerede protokoller til analyse af biogenese og funktion af pc, der er til stede på NSPC’er, ved at teste transduktionen af Sonic Hedgehog-vejen og analysere dynamikken i afgørende molekyler involveret i denne vej. For at drage fordel af 3D-organiseringen af cerebrale organoider oprettede vi også en enkel og omkostningseffektiv metode til 3D-billeddannelse af in toto immunplettede cerebrale organoider, der muliggør hurtig erhvervelse takket være et lysarkmikroskop af hele organoidet med høj opløsning, der gør det muligt at visualisere pc på alle typer neokortikale forfædre og neuroner i hele organoiden. Endelig tilpassede vi immunhistokemi på 150 μm fritsvævende sektioner med efterfølgende clearing og erhvervelse ved hjælp af resonansscanningskonfokalmikroskop, der muliggør billedoptagelse i høj opløsning, hvilket er nødvendigt for den detaljerede analyse af pc-biogenese og funktion. Specifikt tillader 3D-billeddannelsessoftware 3D-rekonstruktion af pc med efterfølgende analyse af morfologiske parametre, herunder længde, antal og orientering af pc samt signalintensitetsmåling af ciliære komponenter langs axonem.
Protocol
Representative Results
Discussion
PC betragtes nu som nøgleorganeller, der regulerer afgørende trin under normal cerebral kortikal udvikling18,19,31, herunder NSPC-udvidelse og engagement8,9,10,11,12 samt neuronal migration13,14 og synaptog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Agence Nationale de la Recherche (ANR) til S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) og N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 og ANR-19-CE16-0002-01). LB støttes af ANR under Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01) og Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-programmet). Imagine Institute støttes af statsfinansiering fra ANR under Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-projekter) og som en del af det andet Investissements d’Avenir-program (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
