מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית
Summary
אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.
Abstract
עיגולים ראשוניים (PC) הם אברונים דינמיים שאינם מבוססי מיקרוטובולה שאינם בעלי רגש, הבולטים מפני השטח של רוב תאי היונקים. הם מגיחים מהמרכז הישן יותר במהלך שלב G1/G0 של מחזור התא, בעוד הם מתפרקים כאשר התאים נכנסים מחדש למחזור התא בגבול הפאזה G2/M. הם מתפקדים כרכזות אותות, על ידי זיהוי והעברה של אותות חוץ-תאיים החיוניים לתהליכי תאים רבים. בדומה לרוב סוגי התאים, כל תאי הגזע העצבי הניאו-קורטיקלי ותאי האב (NSPCs) הוכחו כמעניקים מחסה למחשב המאפשר להם לחוש ולהעביר אותות ספציפיים הנדרשים להתפתחות קליפת המוח המוחית הרגילה. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי ליצור ולאפיין מודלים דו-ממדיים (2D) ותלת-ממדיים (3D) מבוססי תאים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSCs) כדי לנתח עוד יותר את המעורבות של המחשב במהלך התפתחות ניאוקורטית. בפרט, אנו מציגים פרוטוקולים כדי ללמוד את biogenesis PC ולתפקד ב 2D עצבי רוזט נגזר NSPCs כולל ההמרה של מסלול קיפוד סוניק (SHH). כדי לנצל את הארגון התלת מימדי (3D) של אורגנוידים מוחיים, אנו מתארים שיטה פשוטה להדמיה תלת-ממדית של אורגנוידים מוחיים מחוסנים טוטו . לאחר ניקוי אופטי, רכישה מהירה של organoids שלם מאפשר זיהוי של צנטרוזומים ומחשב על אבות neocortical ונוירונים של האורגנויד כולו. לבסוף, אנו מפרטים את ההליך לחיסון וניקוי של מקטעי אורגנויד עבים וצפים חופשיים המשמרים מידה משמעותית של מידע מרחבי תלת-ממדי ומאפשרים את הרכישה ברזולוציה גבוהה הנדרשת לניתוח האיכותי והכמותי המפורט של ביוגנזה ותפקוד PC.
Introduction
עיגולים ראשוניים (PC) הם אברונים מבוססי מיקרוטובול החושים ומשדרים שפע של רמזים כימיים ומכאניים מהסביבה החוץ-תאית. בפרט, PC הוא האברונים המרכזיים עבור transduction של מסלול איתות קיפוד בחולייתנים1,2. בעוד רוב התאים העצביים כבר זמן רב הוכח מחסה מחשב, התרומה של אברון זה בעיצוב מערכת העצבים המרכזית כבר מזמן מוערך. מחקרים על התפתחות ניאוקורטית הובילו לגילוי של תאי גזע עצביים ואבות מרובים (NSPCs), כולם מחסה מחשב, אשר מיקומו הוצע להיות מכריע לקביעת גורל האבות 3,4,5,5,6,7. המחשב הוכח חיוני עבור מנגנוני תאים הנדרשים להתפתחות קליפת המוח המוחית הרגילה, כולל הרחבת NSPC ומחויבות8,9,10,10,11,12, כמו גם קוטביות אפיקובסל של פיגום גליה רדיאלי התומך הגירה עצבית13. בנוסף, מחשב נדרשים במהלך נדידה משיקה interneurons לצלחת קליפת המוח14,15. לבסוף, תפקיד עבור המחשב הוצע בהקמת קשרים סינפטיים של נוירונים בקליפת המוח16,17. בסך הכל, ממצאים אלה טוענים לתפקיד מכריע של המחשב בשלבים העיקריים של התפתחות קליפת המוח18,19 ולהעלות את הצורך לחקור את מעורבותם במנגנונים הפתולוגיים שבבסיס אנומליות של התפתחות קליפת המוח.
מחקרים שנערכו לאחרונה שיפרו במידה רבה את הבנתנו לגבי הבדלים תאיים ומולקולריים חשובים בין התפתחות קליפת המוח במודלים אנושיים ובעלי חיים, תוך הדגשת הצורך לפתח מערכות מודל אנושיות. בתפיסה זו, תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hIPSCs) מייצגים גישה מבטיחה לחקר פתוגנזה של מחלות בהקשר גנטי ותאי רלוונטי. מודלים דו-ממדיים (2D) מבוססי תאים או רוזטות עצביות מכילים NSPCs דומים לאלה שנראו בקליפת המוח המתפתחת, שהופכים מאורגנים למבנים בצורת רוזט המראים קוטביות אפיקובסל נכונה20,21,222. יתר על כן, מערכת התרבות התלת-ממדית (3D) מאפשרת יצירת אורגנוידים עוריים שמכסים מחדש תכונות רבות של התפתחות קליפת המוח האנושית23,24,24,25,26. שתי גישות מידול משלימות אלה מבוססות תאים מציעות פרספקטיבות מרגשות לנתח את המעורבות של המחשב במהלך התפתחות נורמלית ופתולוגית של קליפת המוח.
כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים עבור הדור והאפיון של רוזטות עצביות NSPCs נגזר, כמו גם organoids המוח הקדמי הגב. אנו מספקים גם פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח את הביוגנזה ואת הפונקציה של PC הנוכחי על NSPCs על ידי בדיקת ההמרה של מסלול קיפוד סוניק וניתוח הדינמיקה של מולקולות מכריעות המעורבות במסלול זה. כדי לנצל את הארגון התלת-ממדי של האורגנוידים המוחיים, הקמנו גם שיטה פשוטה וחסכונית להדמיה תלת-ממדית של אורגנוידים מוחיים מחוסנים בטוטו המאפשרים רכישה מהירה, הודות למיקרוסקופ יריעת אור, של האורגנויד כולו, ברזולוציה גבוהה המאפשרת לדמיין מחשב על כל סוגי האבות הניאוקורטיים והנוירונים של האורגנויד כולו. לבסוף, התאמנו אימונוהיסטוכימיה על 150 מיקרומטר משטחים צפים חופשיים עם ניקוי ורכישה לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה מהדהד המאפשר רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה, אשר נדרש לניתוח מפורט של ביוגנזה ותפקוד PC. באופן ספציפי, תוכנת הדמיה תלת-ממדית מאפשרת שחזור תלת-ממדי של המחשב עם ניתוח מאוחר יותר של פרמטרים מורפולוגיים כולל אורך, מספר וכיוון של המחשב, כמו גם מדידת עוצמת האות של רכיבי ciliary לאורך האקסונמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחשב נחשבים כיום אברונים מפתח המסדירים שלבים מכריעים במהלך התפתחות קליפת המוח המוחית נורמלית18,19,31 כולל הרחבת NSPC ומחויבות8,9,10,10,11,12, כמו גם הגירה עצבית13…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן האגנס הלאומי דה לה Recherche (ANR) כדי S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) ו N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 ו ANR-19-CE16-0002-01). LB נתמך על ידי ANR במסגרת תוכנית Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) ו- Fondation Bettencourt Schueller (תוכנית MD-PhD). מכון Imagine נתמך על ידי מימון המדינה מ-ANR במסגרת תוכנית Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, CrossLab פרויקטים) וכחלק מתוכנית Investissements d’Avenir השנייה (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
