2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖
Summary
我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。
Abstract
原発性繊毛(PC)は、ほとんどの哺乳動物細胞の表面から突出する非運動性の動的微小管ベースの細胞小器官である。それらは、細胞周期のG1/G0期に古いセントリオールから出現するが、細胞がG2/M期境界で細胞周期に再び入るにつれて分解する。それらは、多くの細胞プロセスに不可欠な細胞外シグナルを検出して伝達することによって、シグナルハブとして機能します。ほとんどの細胞型と同様に、すべての新皮質神経幹および前駆細胞(NSPC)は、正常な脳皮質の発達に必要な特定のシグナルを感知および伝達することを可能にするPCを保有していることが示されている。ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)から2次元(2D)および3次元(3D)細胞ベースのモデルを生成して特徴付け、新皮質発生中のPCの関与をさらに解剖するための詳細なプロトコルを提供します。特に、ソニックヘッジホッグ(SHH)経路の形質導入を含む2D神経ロゼット由来NSPCにおけるPCの生合成と機能を研究するためのプロトコルを提示する。脳オルガノイドの三次元(3D)組織を利用するために、我々は、 ヒトト 免疫染色された大脳オルガノイドの3Dイメージングのための簡単な方法を説明する。光学的クリアリングの後、オルガノイド全体の迅速な取得は、オルガノイド全体の新皮質前駆細胞およびニューロン上のセントロソームおよびPCの両方の検出を可能にする。最後に、かなりの程度の3D空間情報を保持し、PCの生合成と機能の詳細な定性的および定量的分析に必要な高解像度取得を可能にする、厚い自由浮遊オルガノイド切片の免疫染色および除去の手順を詳述します。
Introduction
原発性繊毛(PC)は微小管ベースの細胞小器官であり、細胞外環境からの多数の化学的および機械的手がかりを感知し、伝達する。特に、PCは脊椎動物におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の形質導入のための中心的な細胞小器官である1,2。ほとんどの神経細胞がPCを保有することが長い間示されてきましたが、中枢神経系の形成におけるこのオルガネラの貢献は長い間過小評価されてきました。新皮質の発達に関する研究は、複数の神経幹および前駆細胞(NSPC)の発見につながり、そのすべてがPCを保有しており、その場所は前駆者の運命決定に不可欠であることが提案されている3,4,5,6,7。PCは、NSPCの拡張とコミットメント8,9,10,11,12、ならびにニューロンの遊走をサポートする放射状グリア足場のアピコ基底極性を含む、正常な脳皮質の発達に必要な細胞メカニズムにとって重要であることが示されています13。加えて、PCは皮質プレートへの接線移動の間に介在ニューロン14、15必要とされる。最後に、大脳皮質におけるニューロンのシナプス結合の確立におけるPCの役割が提案されている16,17。全体として、これらの知見は、脳皮質発達の主要な段階におけるPCの重要な役割を主張し18,19、脳皮質発達の異常の根底にある病理学的メカニズムへのPCの関与を調査する必要性を提起する。
最近の研究は、ヒトモデルと動物モデルにおける皮質発生の間の重要な細胞および分子の違いについての理解を大幅に改善し、ヒトモデルシステムを開発する必要性を強調している。この見解では、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)は、関連する遺伝的および細胞的文脈における疾患病因を研究するための有望なアプローチを表す。付着した2次元(2D)細胞ベースのモデルまたは神経ロゼットは、発達中の大脳皮質に見られるものと同様のNSPCを含み、正しいアピコ基底極性を示すロゼット状の構造に組織化される20,21,22。さらに、三次元(3D)培養システムは、ヒト脳皮質発達の多くの特徴を再現する背側前脳オルガノイドの生成を可能にする23、24、25、26。これら2つの相補的な細胞ベースのモデリングアプローチは、大脳皮質の正常および病理学的発達中のPCの関与を解剖するためのエキサイティングな視点を提供する。
ここでは、神経ロゼットおよび由来NSPCならびに背側前脳オルガノイドの生成および特性評価のための詳細なプロトコルを提供する。また、ソニックヘッジホッグ経路の形質導入を試験し、この経路に関与する重要な分子のダイナミクスを分析することにより、NSPCに存在するPCの生合成と機能を解析するための詳細なプロトコルも提供しています。また、大脳オルガノイドの3D組織を活用するため、 in toto 免疫染色された大脳オルガノイドの3Dイメージングのための簡単で費用対効果の高い方法を設定し、オルガノイド全体の高分解能で、ライトシート顕微鏡により、オルガノイド全体のあらゆる種類の新皮質前駆細胞およびニューロン上のPCを視覚化することができます。最後に、150μmの自由浮遊切片に免疫組織化学を適応させ、その後、共鳴走査型共焦点顕微鏡を用いた透明化と取得により、PCの生合成と機能の詳細な解析に必要な高解像度の画像取得を可能にしました。具体的には、3Dイメージングソフトウェアは、PCの長さ、数、向きなどの形態学的パラメータのその後の分析、ならびに軸索に沿った毛様体成分の信号強度測定によるPCの3D再構成を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
PCは現在、NSPCの拡大とコミットメント8,9,10,11,12、ならびにニューロン移動13,14およびシナプト形成16,17を含む、正常な脳皮質発達中の重要なステップを調節する重要な細胞小器官と見なされています16,17</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Agence Nationale de la Recherche(ANR)からS.T.(ANR-17-CE16-0003-01)およびN..B.B.(ANR-16-CE16-0011およびANR-19-CE16-0002-01)への助成金によって支援されました。LBは、Investissements d’avenirプログラム(ANR-10-IAHU-01)とFondation Bettencourt Schueller(MD-PhDプログラム)の下でANRによってサポートされています。イマジン・インスティテュートは、Investissements d’avenirプログラム(ANR-10-IAHU-01、CrossLabプロジェクト)の下で、また第2次Investissements d’Avenirプログラム(ANR-17-RHUS-0002)の一環として、ANRからの国家資金によって支援されています。
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
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