Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Abstract

Primer cilia (PC), çoğu memeli hücresinin yüzeyinden çıkıntı yapan hareketli olmayan dinamik mikrotübül bazlı organellerdir. Hücre döngüsünün G1/G0 fazı sırasında eski centriole'den çıkarken, hücreler G2/M faz sınırında hücre döngüsüne yeniden girdikçe parçalara ayırırlar. Birçok hücre işlemi için çok önemli olan hücre dışı sinyalleri algılayarak ve aktararak sinyal hub'ları olarak işlev görürler. Çoğu hücre tipine benzer şekilde, tüm neokortik nöral kök ve progenitör hücreler (NSPC'ler), normal serebral kortikal gelişim için gerekli olan spesifik sinyalleri hissetmelerini ve dönüştürmelerini sağlayan bir PC barındırmaktadır. Burada, neokortik gelişim sırasında PC'nin katılımını daha fazla parçalamak için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hIPSC) iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) hücre tabanlı modeller oluşturmak ve karakterize etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Özellikle, SONIC Hedgehog (SHH) yolunun transdüksiyonu da dahil olmak üzere 2D nöral rozet türevi NSPC'lerde PC biyogenezini incelemek ve işlev görmek için protokoller sunuyoruz. Serebral organoidlerin üç boyutlu (3D) organizasyonundan yararlanmak için , toto immünostained serebral organoidlerin 3D görüntülemesi için basit bir yöntem tarif ediyoruz. Optik temizlemeden sonra, tüm organoidlerin hızlı bir şekilde edinimi, tüm organoidin neokortik progenitörlerinde ve nöronlarında hem centrozomların hem de PC'nin tespit edilmesine izin verir. Son olarak, 3D mekansal bilgilerin önemli bir derecesini koruyarak ve PC biyogenezinin ve işlevinin ayrıntılı nitel ve nicel analizi için gereken yüksek çözünürlüklü kazanıma izin vererek kalın serbest yüzen organoid bölümlerinin immünostaining ve temizlenmesi prosedürünü detaylandırıyoruz.

Introduction

Birincil cilia (PC), hücre dışı ortamdan çok sayıda kimyasal ve mekanik ipucunu algılayan ve transdükleyen mikrotübül bazlı organellerdir. Özellikle, PC omurgalılarda Kirpi sinyal yolunun transdüksiyonunun merkezi organeldir1,2. Çoğu sinir hücresinin uzun zamandır bir PC barındırdığı gösterilmiş olsa da, bu organel merkezi sinir sistemini şekillendirmedeki katkısı uzun zamandır değersizdir. Neokortik gelişim üzerine yapılan çalışmalar, hepsi bir PC barındıran, konumu ata kader tespiti için çok önemli olduğu öne sürülen birden fazla sinir sapı ve progenitör hücrenin (NSPC) keşfine yol açmıştır3,4,5,6,7. PC, NSPC genişlemesi ve taahhüdü8,9,10,11,12 ve nöronal göçü destekleyen radyal glial iskelenin apikobasal polaritesi de dahil olmak üzere normal serebral kortikal gelişim için gerekli hücre mekanizmaları için çok önemli gösterilmiştir13. Ek olarak, internöronların kortikal plakaya teğet geçişi sırasında PC gereklidir14,15. Son olarak, serebral kortekste nöronların sinaptik bağlantılarının kurulmasında PC için bir rol önerilmiştir16,17. Tamamen, bu bulgular SEREBRAL KORİkAL Gelİşİmİn ANA ADIMLARUNDA PC'nin önemli bir rolünü savunuyor18,19 ve serebral kortikal gelişimin anomalilerinin altında kalan patolojik mekanizmalara katılımlarını araştırma ihtiyacını gündeme getirmektedir.

Son çalışmalar, insan ve hayvan modellerinde kortikal gelişim arasındaki önemli hücresel ve moleküler farklılıklar hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiş, insan modeli sistemleri geliştirme ihtiyacını vurgulamıştır. Bu görüşe göre, insan indüklenen pluripotent kök hücreler (hIPSC' ler), hastalık patogenezini ilgili genetik ve hücresel bağlamda incelemek için umut verici bir yaklaşımı temsil eder. Yapışık iki boyutlu (2D) hücre bazlı modeller veya nöral rozetler, doğru apikobasal polarite gösteren rozet şeklindeki yapılara dönüşen gelişmekte olan serebral kortekste görülenlere benzer NSPC'ler içerir20,21,22. Ayrıca, üç boyutlu (3D) kültür sistemi, insan serebral kortikal gelişiminin birçok özelliğine yeniden yol açan dorsal forebrain organoidlerinin üretilmesine izin verir23,24,25,26. Bu iki tamamlayıcı hücre tabanlı modelleme yaklaşımı, serebral korteksin normal ve patolojik gelişimi sırasında PC'nin katılımını parçalamak için heyecan verici bakış açıları sunar.

Burada, nöral rozetlerin ve türetilmiş NSPC'lerin yanı sıra dorsal forebrain organoidlerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Ayrıca, Sonic Hedgehog yolunun transdüksiyonunu test ederek ve bu yolda yer alan önemli moleküllerin dinamiklerini analiz ederek NSPC'lerde bulunan PC'nin biyogenezini ve işlevini analiz etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Serebral organoidlerin 3D organizasyonundan yararlanmak için, tüm organoidin ışık tabakası mikroskobu sayesinde hızlı bir şekilde edinilmesine izin veren toto immünostained serebral organoidlerin 3D görüntülenmesi için basit ve uygun maliyetli bir yöntem belirledik ve tüm organoidin her türlü neokortik progenitör ve nöronlarında PC'yi görselleştirmeyi sağlayan yüksek çözünürlükte. Son olarak, 150 μm serbest yüzen bölümlere immünhistokimyayı, PC biyogenezinin ve işlevinin ayrıntılı analizi için gerekli olan yüksek çözünürlüklü görüntü alımına izin veren rezonans tarama konfokal mikroskobu kullanarak daha sonra temizleme ve edinme ile uyarladık. Özellikle, 3D görüntüleme yazılımı, PC'nin uzunluğu, sayısı ve yönü dahil olmak üzere morfolojik parametrelerin sonraki analizi ve akonem boyunca silier bileşenlerin sinyal yoğunluğu ölçümü ile PC'nin 3D rekonstrüksiyonuna izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Neokortik gelişimin 2D hIPS hücre tabanlı modellerinin üretimi

  1. Nöral rozet oluşumu
    1. Büyük düzenli kolonileri barındıran, % 10'dan az farklılaşma ve% 80'den fazla şekerleme olmayan hIPSC kültürleri ile başlayın.
    2. HIPSC'leri 2 mL PBS ile durulayın.
    3. Kaya inhibitörü (NIM + 10 μM Y-27632) ile desteklenmiş 2 mL NSPC indüksiyon ortamı ekleyin.
    4. Her bir hIPSC kolonisini bir 35 mm'lik çanaktan manuel olarak parçalara ayırarak her koloniyi tam olarak yatay ve dikey yönlerde kesmek için her koloniyi eşit kümelere bölen bir dama tahtası deseni oluşturun.
    5. Koloniyi bir hücre kazıyıcı kullanarak ayırın ve ultra düşük ekli 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
    6. Embriyoid cisimleri (EBs) oluşturabilmeleri için 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca (ON) yüzmelerine izin verin.
      NOT: Embriyoid cisimler (EBs), yüzen küresel kümeler veya hIPSC'lerin agregaları olarak tanımlanır.
    7. 2 mL NIM + 10 μM Y-27632'de 35 mm'lik poli-L-ornit/laminin (PO/lam) kaplı 35 mm'lik yemeklere ES'leri aktarın.
    8. Yaklaşık 12 ila 14 gün süren nöral rozetlerin oluşumuna kadar günlük yenileme NSPC indüksiyon ortamı (Y-27632 içermeyen NIM). Mikroskobun altına bak.
      NOT: Bu adımdan sonra nöral rozetler genişletilebilir, ayırt edilebilir ve immünostaining analizi için işlenebilir veya izole nöral kök ve progenitör hücreler (NSPC' ler) elde etmek için ayrıştırılabilir.
  2. Nöral rozet genişlemesi ve erken farklılaşma
    1. Sinirsel rozetleri ibreyle ızgara benzeri bir desende kesin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kümeleri yerinden sökün.
    2. Rozetleri, 0,5 mL NSPC bakım ortamında (NMM) PO/lam kaplı cam kapak kapağı (4-5 rozet/kuyu) içeren 4 kuyulu bir tabağa aktarın.
    3. Plakayı 37 °C ve%5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
    4. NMM'yi 20.
    5. 20. günden itibaren, farklılaşmaya izin vermek için 0,5 mL sitokin tüketilmiş NMM'deki kültür sinir rozetleri. Ortamı her 2-3 günde bir yenileyin.
    6. 30. Gün ve 40.
  3. İzole NSPC'lerde PC biyogenez ve fonksiyon analizi
    1. NSPC ayrışması
      1. Nöral rozetleri adım 1.1.8'den ibreyle ızgara benzeri bir desende kesin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kümeleri yerinden sökün. Hücreleri 2 mL NMM'de PO/lam kaplı 35 mm'lik yemeklere aktarın ve 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
      2. NMM'yi iki günde bir izdiah edene kadar yenileyin (yaklaşık 5-7 gün).
      3. Sinir rozetlerini çevreleyen büyük, berrak hücreleri kazıdıktan sonra, manuel olarak seçin ve NSPC'ler için zenginleştirmek ve sinirsel olmayan hücre tiplerini tükenmek üzere taze PO / lam kaplı 35 mm'lik yemeklere aktarın.
      4. Tüm kirletici hücre tiplerini çıkarmak için gereken bir veya iki manuel geçişten sonra (gerekirse 1.3.1.3 adımını tekrarlayın), ortamı çıkarın ve PBS ile durulayın.
      5. % 0,05 trypsin 300 μL ekleyin ve çoğu hücre kopana kadar 37 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
      6. Trypsin'i devre dışı bırakmak için %10 FBS (DMEM + %10 FBS) içeren ortamın 2 mL'sini ekleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpte toplayın. Hücre kümelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu üç kez yavaşça pipetle.
      7. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
      8. Süpernatantı dikkatlice emiş ve NMN'deki hücreleri yeniden biriktirin.
      9. Ayrışmış NSPC'leri NMM'de tek hücreli (1 x 105 hücre/cm2) PO/lam kaplı yemeklere tohumlayın ve 37 °C ve%5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
      10. Ortamı iki günde bir değiştirerek NMM'deki NSPC'leri genişletin.
        NOT: NSPC'ler farklılaşmayı önlemek için yüksek yoğunlukta tohumlanır.
    2. PC biyogenez analizi
      1. Tohum NSPC'leri 100.000 hücre/cm2'de ayrıştırır ve 2 gün boyunca 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde ve NMM'de%5 CO2'de kuluçkaya yatırır.
      2. Ortamı epire edin ve sitokin tükenmiş ortamda (NSPC açlık ortamı, Ek Tablo 1) 48 saat boyunca NSPC'leri aç bırakın.
      3. RT'de 20 dakika boyunca %4 PFA ile NSPC'leri düzeltin.
      4. İmmünasyondan önce RT'de PBS ile iki kez 5 dakika yıkayın.
    3. PC fonksiyon analizi: SHH sinyal yolu
      1. Tohum, PO/lam kaplı 8 kuyulu Oda Kaydıracılarında (300 μL) veya T25 tabaklarda (5 mL) 100.000 hücre/cm2'de NSPC'leri ayrıştırdı ve 2 gün boyunca 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde ve NMM'de% 5 CO2'de kuluçkaya yatırıldı.
      2. NSPC açlık ortamında (8 kuyulu oda kaydırağı kuyusu başına 300 μL ve T25 şişesinde 5 mL) 48 saat boyunca NSPC'leri aç bırakın.
      3. SHH yolunu indüklamak için, NSPC'leri rekombinant SHH (100 ng/mL) veya SAG (500 nM) ile desteklenmiş açlık ortamıyla kuluçkaya yatırın; (8 kuyulu oda kaydırasının kuyusu başına 150 μL ve T25 şişesinde 2 mL) 24 saat boyunca.
      4. RT'de 20 dakika boyunca kuyu başına %4 PFA'nın 250 μL'sinde 8 kuyulu Oda Kaydıraklarında kültürlenmiş NSPC'leri düzeltin ve immünasyon analizinden önce RT'de 5 dakika boyunca 250 μL PBS ile iki kez yıkayın.
      5. Ortamı çıkarın ve T25 yemeklerinde kültürlenmiş NSPC'leri PBS ile yıkayın.
      6. % 0,05 tripsin 500 μL ekleyin ve hücreler kopana kadar 37 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
      7. Tripsin'i devre dışı bırakmak ve hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpte toplamak için% 10 FBS (DMEM + % 10 FBS) içeren 2 mL orta ekleyin.
      8. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın ve RNA ekstraksiyonu ve RT-PCR analizinden önce -80 °C'de kriyoprezizasyon yapılabilen NSPC peletleri elde etmek için süpernatantı dikkatlice arzu edin.

2. Dorsal forebrain organoidlerinin üretimi

  1. HIPSC'lerin tek hücreli kültürü
    1. %10'dan daha az farklılaşma gösteren ve neredeyse bir kez geçiş yapılan büyük düzenli kolonileri barındıran hIPSC kültürleri ile başlayın. Hücrelerin %80'den fazla birleştiğinden emin olun.
    2. Kolonileri 2 mL PBS ile yıkayın.
    3. 500 μL Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi (GCDR) ekleyin ve 37 °C'de 5 ila 7 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. GCDR'yi epire edin ve 5 μM Y-27632 ile desteklenmiş 2 mL mTeRS1 ortamı ekleyin.
    5. Tüm kolonileri tek bir hücreye ayrıştırmak için hücreleri 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı borulayın.
    6. Vitronektin kaplı tabaklardaki hücreleri aktarın ve 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
      NOT: HIPSC'leri tek hücreli kültür koşullarına uyarlamak için farklılaşma denemesinden önce GCDR kullanarak hIPSC'lerin en az 1 geçişini gerçekleştirin.
  2. 0. Günde, hIPSC'lerin düşük FGF2 konsantrasyonu ve hIPSC sağkalım için gereken yüksek konsantrasyonda kaya inhibitörü içeren EB ortamında embriyonik cisimler oluşturmasına izin verin. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Kolonileri 2 mL PBS ile yıkayın.
    2. 500 μL Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi (GCDR) ekleyin ve 37 °C'de 5 ila 7 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. GCDR'yi aspire edin ve 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL EB ortamı ekleyin; Hücreleri hafifçe ayırmak ve 15 mL konik bir tüpe aktarmak için 1 mL pipet kullanın.
    4. 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 2 mL EB ortamı ile bir kez daha durulayın, kalan hücreleri 15 mL konik tüpe aktarın. Konik tüpe hemen 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 mL EB ortamı ekleyin ve çözeltiyi 5 mL pipet kullanarak hafifçe homojenize edin.
    5. Ayrışmış hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj edin.
    6. Süpernatantı hafifçe emiş edin ve hücreleri 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 6 mL EB ortamında yeniden biriktirin.
    7. Hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj edin.
    8. Süpernatantı epire edin ve hücreleri 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL EB ortamında yeniden biriktirin. Hücreleri tek hücreli bir süspansiyona hafifçe ayrıştırmak için 1 mL pipet kullanın.
    9. Hücreleri yeniden steril ettikten hemen sonra seyreltin ve sayın.
    10. Uygun hücre süspansiyonu hacmini (900.000 hücre içeren) 50 μM Y-27632 ve 4 ng/mL bFGF ile desteklenmiş 30 mL EB ortamına seyreltin ve çözeltiyi hafifçe karıştırın.
    11. Plaka 9.000 hücre/kuyuda ultra düşük ekli 96U plakaya (300 μL/kuyu). Rahatsız edici EB oluşumunu önlemek için, plakayı orta değişiklik olmadan 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde ve% 5 CO2'de 3.
  3. Nöral indüksiyon (Çift SMAD inhibisyonu)
    1. 3. Günde, EBs'nin 300-400 μm ölçtmesini ve düzenli sınırları göstermesini sağlayın. Her iki kritere de ulaşılırsa, ortamın yarısını (150 μL) Çift SMAD inhibitörleri içeren indüksiyon orta-1 ile değiştirin, bu da 6- 7. güne kadar ED'lerin konturunun aydınlatılmasına yol açan nöroektodermal farklılaşmayı gösterir (Ek Tablo 2).
    2. 4. Günde, ortamın 3/4'ü (225 μL) indüksiyon orta-1 ile değiştirin.
    3. 6. gün ve 8. gün: İndüksiyon orta-1'in yarısını yenileyin (150 μL).
  4. Bodrum membran matrisine organoid gömme (Gün 10)
    1. 10. günde, EBs'yi büyüme faktörüne katıştırarak bodrum membran matrisini (BMM) azaltın.
      NOT: Bu adımdan itibaren, tekrarlanan pipetleme ile organoidlere zarar vermemek için pipet uçlarının açılmasını kesmek için her zaman steril makas kullanın.
    2. konik tüplerde 15-17 organoid civarında ilk transfer. ÖK'lerin yerleşmesine ve ortamı kaldırmasına izin verin. 50 μL indüksiyon orta-2 ekleyin ve bunları 100 μL BMM içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. Matris-EB karışımını ultra düşük bağlantı plakasının kuyusunun ortasına yayın ve kaynaşmalarını önlemek için EB'leri ayırın.
    4. BMM'nin 37 °C'de inkübatörde 45 dakika katılaşmasını sağlar.
    5. Her kuyuya 3 mL indüksiyon orta-2 ekleyin ve plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre koyun.
      NOT: Bmm oda sıcaklığında katılaştıkça bu işlemin mümkün olduğunca çabuk yapıldığından emin olun.
  5. Bodrum membran matrisine gömülü organoidlerin sabit kültürü
    1. 12. Gün, 14: İndüksiyon orta-2'yi yenileyin.
    2. 16. Gün: İndüksiyon orta-2'yi yenileyin ve mikroskop altında nöroepithelial döngülerin genişlemesini kontrol edin.
  6. Yörüngesel çalkalayıcıda bodrum membran matrisi ayrışması ve kültürü
    1. 17. günde, organoidleri 5 mL pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetle bmm'den ayırır ve farklılaşma orta-1'e (A vitamini olmadan) aktarın. Beslenme emilimini iyileştirmek için 37 °C ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 80 rpm'de bir yörüngesel çalkalayıcıya inkübasyon.
      NOT: Sabit kültür ve kültür için yörüngesel bir çalkalayıcı üzerine farklı bir inkübatör kullanarak, bağlı hIPS hücre büyümesine zarar verici titreşimleri önler.
    2. 19. Gün: Farklılaşmayı yenile orta-1.
    3. 21. Gün: Farklılaşma orta-1'i farklılaşma orta-2 (A vitamini ile) olarak değiştirin.
    4. 23. Günden 35. Güne: Ortamı her 2-3 günde bir farklılaşma ile orta-2 ile yenileyin.
    5. 35. Günden 70. Güne: Farklılaşmayı %1 BMM ile orta-2'de yenileyin ve 2-3 günde bir yenileyin.
    6. Organoidleri 28, 42 ve 70 +/- 2 günlük farklılaşmadan sonra toplayın ve 15 mL konik tüpte 5 mL% 4 PFA'da 4 °C'de bir gecede sabitlayın.
    7. Toto veya serbest yüzen immünostaining analizinde daha fazla bilgi için organoidler PBS'de iki kez durulanır ve PBS + % 0.05 sodyum azide 4 °C'de korunur.
    8. Donmuş bölümlerde immünostaining analizi için, %4 PFA sabit organoidleri +4 °C AÇIK'ta (veya organoidler batana kadar) 10 mL%30 sakkaroza daldırin. Onları donmuş gömme matrisine gömün ve kriyoseksiyona kadar -80 °C'de saklayın.

3. Dorsal forebrain organoidlerinin toto immünolabeling, temizleme ve ışık tablosu alımında

  1. Fiksasyon
    1. Organoidleri 6 kuyulu plakalarda toplayın, ortamı çıkarın ve bir gecede 4 °C'de% 4 PFA'nın 2 mL'si ile sabitlayın.
    2. Oda sıcaklığında 2 mL PBS'de üç yıkama gerçekleştirin.
    3. Organoidleri 2 mL tüplere aktarın ve 2 mL PBS + % 0.05 sodyum azide 4 °C'de saklayın.
  2. Permeabilizasyon
    1. Organoidleri 1 saat boyunca RT'de %0,2 Triton X100 içeren 1 mL PBS'de kuluçkaya yatırın. Bunu iki kez yap.
    2. %0,2 Triton X100 ve %20 DMSO içeren PBS'nin 1 mL'sinde bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    3. %0,1 Tween20, %0,1 Triton X100, %0,1 Deoxycholate, %0,1 NP40 ve %20 DMSO içeren PBS'nin 1 mL'sinde bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    4. 1 saat boyunca RT'de %0,2 Triton-X100 içeren 1 mL PBS'de kuluçkaya yaslanın. Bunu iki kez yap.
  3. Engelleme ve immünoblabeling
    1. 37 °C, ON'da 1 mL bloklama çözeltisi (PBS, %0,2 Triton X100, %6 Eşek Serumu,%10 DMSO).
    2. 2 gün boyunca 37 °C'de 250 μL PBS, %0,2 Tween20, 0,1 μg/mL Heparin, %5 DMSO ve %3 Eşek Serumu'nda seyreltilmiş primer antikorlarla kuluçkaya yatırın.
    3. %0,2 Tween20 ve 0,1 μg/mL Heparin içeren 1 mL PBS'de 1 saat boyunca 37 °C'de yıkayın. Bunu dört kez yap.
    4. %0,2 Tween20 ve 0,1 μg/mL Heparin içeren 1 mL PBS'de bir gecede 37 °C'de yıkayın.
    5. 2 gün boyunca 37 °C'de %0,2 Tween 20, 0,1 μg/mL Heparin ve %3 Eşek Serumu içeren 250 μL PBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.
    6. 0.2% Ara 20 ve 0.1 μg / mL Heparin içeren 1 mL PBS'de, 1 saat boyunca, bir tekerlek üzerinde, RT'de yıkayın. Bunu dört kez yap.
    7. Rt'de bir gecede% 0.2 Ara 20 ve 0.1 μg / mL Heparin içeren 1 mL PBS'de yıkayın.
    8. RT'de 24 saat boyunca 1 mL PBS'de yıkayın.
    9. Temizleyene kadar 1 mL PBS'de +4 °C ve %0,05 sodyum azide stok.
  4. TDE'de Takas (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Organoidleri RT'de 24 saat boyunca %30 TDE'nin 1 mL'sinde (3 mL TDE + 7 mL PBS) kuluçkaya yatırın.
    2. RT'de 24 saat boyunca %60 TDE 'nin (6 mL TDE + 4 mL PBS) 1 mL'sinde kuluçkaya yatırın.
    3. RT'de 24 saat boyunca %80 TDE'nin (8 mL TDE + 2 mL PBS) 1 mL'sinde kuluçkaya yatırın.
  5. Işık tabakası alımından önce organoid gömme
    NOT: Özel yapım bir sistem kullanın; neşterle kesilmiş ucu ile 1 mL şırınna ile yapılır.
    1. %60 TDE çözeltisinde %4 Düşük Erimeli Agarose'un 100 mL'sini ve 2 mL tüplerde aliquot hazırlayın. +4 °C'de tasarruf edin.
    2. Organoid gömmeden önce, %60 TDE'de %4 düşük erimeli agarosenun 1,5 mL'sini içeren bir tüpü sıvılaşına kadar 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtın.
    3. Bu arada, ucu neşter kullanılarak kesilen 1 mL şırıngamdan yapılmış özel yapım bir kalıplama sistemi hazırlayın.
    4. Pistonu kullanarak jel çözeltisinin şırınd 600 μL'sinde pompala.
    5. Numuneyi, açıklığı steril makas kullanılarak kesilmiş genişlemiş bir pipet ucu kullanarak konumlandırın.
    6. Şırınnayı 400 μL jel çözeltisi ile doldurun, böylece numune şırınnanın alt üçte birine yerleşmiştir.
    7. Jel polimerize ve 4 °C'de% 80 TDE çözeltisinde depolamak elde kadar ışıktan korunmasını bırakın.
    8. Işık sayfası alımı için, temizleme yönteminin kırılma indeksine doğru bir şekilde uyum sağlamak için numune odasına eklenen% 80 TDE çözümüne dalmış 20x hedefi kullanın.
    9. Agarose gömülü organoid içeren şırıngayı, pistonu hedefin önüne yerleştirmek için çalıştırılabilen 1 mL şırıngaya uyum sağlayacak şekilde tasarlanmış en büyük numune tutucusuna yerleştirin.
      NOT: Tüm organoidin ışık tabakası alımı yaklaşık 5 ila 10 dakika sürer.

4. Dorsal forebrain organoidlerinin serbest yüzen bölümlerinin immünostaining ve temizlenmesi

  1. Fiksasyon, agarose gömme ve organoidlerin bölümlenmesi
    1. 6 kuyulu bir plakada 28, 42 ve 70 +/- 2 günlük farklılaşmadan sonra organoidleri toplayın ve %4 PFA'nın 2 mL'sinde 4 °C'de bir gecede sabitlayın.
    2. 2 mL PBS'de iki kez durulayın ve 2 mL PBS + % 0.05 sodyum azide 4 °C'de tasarruf edin.
    3. Sabit organoidleri plastik gömme kalıbına (7 x 7 mm) % 4 düşük eriyen agarose içine gömün. Agarose bloğunu plastik kalıptan dikkatlice çıkarın ve vibratom aşamasına yapıştırın.
    4. Bölümlere zarar vermemek için bir boya fırçası kullanarak 500 μL PBS içeren 24 kuyulu bir plakanın kuyusunda aktarılan 150 μm serbest yüzen bölüm elde etmek için vibratom kullanarak gömülü organoidleri bölümle.
      NOT: Erime sıcaklığı sadece yaklaşık 60 °C olduğu için düşük eriyen agarose önerilir. PBS çözeltisinde% 4 düşük eriyen agarose hazırlayın ve organoid gömmeden önce bir su banyosunda 37 ° C'nin hemen üzerinde soğumaya bırakın.
  2. Permeabilizasyon, blokaj ve immünostaining
    1. Bölümleri 500 μL PBS'de % 0,3 Triton X100 içeren, RT'de, ajitasyon altında 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Bunu üç kez yap.
    2. Bölümleri% 0.3 Triton X100 ve% 5 yağsız Süt içeren 500 μL PBS'de, RT'de, ajitasyon altında, 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    3. Bölümleri 250 μL primer antikor çözeltisinde (PBS + % 0.3 Triton X100 + % 1 yağsız Süt), ajitasyon altında, +4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
    4. Bölümleri 500 μL PBS'de, RT'de, ajitasyon altında 20 dakika boyunca yıkayın. Bunu dört kez yap.
    5. Bölümleri 250 μL ikincil antikor çözeltisinde (PBS + % 0.3 Triton X100 + % 1 yağsız süt), RT'de, ajitasyon altında 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Bölümleri 500 μL PBS'de, RT'de, ajitasyon altında 20 dakika boyunca yıkayın. Bunu dört kez yap.
    7. Bölümleri temizleyene kadar +4° C'de 500 μL PBS'de saklayın.
  3. TDE'de Takas (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Bölümleri RT'de her biri 1 saat boyunca %30 μL ve %60 TDE'de 500 μL'de ve ardından bir gecede %80 TDE'nin 500 μL'sinde KULUÇKAYA YATIRIN.
    2. Temizlenen bölümleri +4 °C'de elde edilene kadar %80 TDE'nin 500 μL'sinde saklayın.
  4. Rezonans tarama konfokal ile satın alarak önce serbest yüzen bölümlerin montajı
    1. Numuneyi %80 TDE çözeltisinde muhafaza etmeyi sağlayan ve konfokal mikroskopların motorlu XY aşamasına uyum sağlamak için tasarlanmış, sızdırmaz bir hazneye serbest yüzen bir bölüm monte edin.
    2. Oda sistemine bir yuvarlak kapak kılıfı koyun.
    3. Temizlenmiş immünostained bölümü bir boya fırçası kullanarak dikkatlice aktarın.
    4. Odayı % 80 TDE çözeltisi ile doldurun.
    5. İki standart kapak kılıfı artı bir ikinci yuvarlak kapak kılıfı ve silikon conta ekleyin.
    6. Sistemi mükemmel bir şekilde kapatmak için haznenin vidalama halkasını vidaleyin.

5. Işık tabakası ve rezonans tarama konfokal analizi

  1. Tüm immünostained örneğin 3D görselleştirme ve analizini sağlayan yazılımı kullanarak ışık levhası ve rezonans tarama alımlarını işleyin.
    NOT: Bu tür yazılımlar, anlık görüntüleri ve animasyonları kolayca yapmak için büyük verileri hızlı bir şekilde açmanıza izin verir. Örneğin XY ve YZ gibi farklı yönlerdeki 2D dilimleyici aracı sayesinde numunenin farklı yönlerde hareket ettirip 2D görünümler oluşturmasına olanak tanır.
  2. Hem centrosomes hem de birincil cilia'nın otomatik olarak algılanmasını sağlamak için, patolojik ve kontrol koşullarında sayılarını ölçmeyi sağlayan bir nokta sihirbazı kullanın.
  3. Uzunluklarının hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayan bilgisayarın 3D yeniden yapılandırılması için, bilgisayarın başlangıç noktasını manuel olarak düzeltmek için bir filament sihirbazı kullanın ve yazılım bilgisayarı tam olarak yeniden oluşturmak için floresan sinyalini kullanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Birincil sesiyum biyogenez ve fonksiyonu incelemek için 2D hIPS hücre bazlı modeller
Burada detaylandırılan protokol daha önce yayınlanan çalışmalardan uyarlanmıştır20,21,22. Bu protokol, gelişmekte olan neokortekste görülenlere benzer neokortik progenitörler ve nöronlar içeren nöral rozet yapılarının üretilmesine izin verir. Ayrıntılı doğrulama, spesifik yapıcılar kullanılarak geleneksel immünostaining analizi ile gerçekleştirilebilir3. Örneğin, apikal progenitörler (AP) SOX2 ve PAX6 ile çift lekelenmeli, ara alerjenler (IP) TBR2/EOMES boyama ile, erken doğan neokortik nöronlar ise CTIP2 boyama ile ortaya çıkar (Şekil 1A-C). Bu tür nöral rozet benzeri yapılar, mitotik çekirdeği ve TPX2'yi lekeleyen fosfo-vimentine karşı yükseltilen antikorlarla immünostainasyon ile görselleştirilebilen AP'nin interkinetik nükleer göçlerini (INM) model eder. Bu nedenle, bu belirteçler, hücre bölünmesi olan INM'nin merkezi lümen (Şekil 1D,D') etrafında apically gerçekleşmesi ve bölme düzlemi ile apikal yüzey arasındaki açıyı ölçerek belirlenen bölme modu da dahil olmak üzere AP'nin çeşitli özelliklerinin analizine izin verir. Son olarak, siliogenez, PC'nin bazal gövdesini lekeleyen PCNT ve akonemi lekeleyen ARL13B'ye karşı yükseltilen antikorlarla immünostaining ile analiz edilebilir. Bu tür rozet yapılarında, PC AP'lerin apikal kutbundan her ventrikül benzeri bölgenin merkezi lümenine kadar uzanır (Şekil 1E,E'), aynı zamanda CTIP2 + nöronlardan çıkıntılıdır (Şekil 1E'').

Bu rozet yapılarının ayrışması, karyotip anormallikleri biriktirmeden en az 15 pasaj için istikrarlı ve genişletilebilir bir NSPC popülasyonunun korunmasına izin vermek için NMM'deki poli-L-ornit/laminin kaplı kültür plakalarında yüksek yoğunlukta kültürlenmiş izole NSPC'lerin elde edilmesini sağlar21,27. PC biyogenez analiz etmek için, ayrışmış NSPC'ler bir araya gelmek üzere kültürlenir ve 48 saat aç kalır. PC işaretleyicilerine karşı yükseltilen antikorlar kullanılarak yapılan immünostaining analizleri, bu NSPC'lerin PC barındırdığını göstermektedir (Şekil 2A). İki tamamlayıcı açık kaynak aracını birleştirerek, PC segmentasyonu28 için yararlı bir makine öğrenimi tabanlı görüntü analiz aracı olan Ilastik ve 3D konfokal görüntü yığınlarından PC'nin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlayan bir Fiji / ImageJ eklenti paketi29 olan CiliaQ, PC sayısı ve uzunlukları da dahil olmak üzere çeşitli yapısal parametreler kolayca değerlendirilebilir.

NSPC'lerin PC işlevi, Kirpi sinyal yolunun transdüksiyonu test edilerek de değerlendirilebilir. SHH sinyal yolunun transdüksiyonunun değerlendirilmesi için NSPC'ler 48 saat aç kalır ve 24 saat boyunca rekombinant SHH (rSHH) veya yumuşatılmış agonist (SAG) ile tedavi edilir. GPR161, SMO ve GLI2'ye karşı yükseltilen antikorları kullanan immünofluoresan (IF) analizi, bu önemli SHH sinyal aktörlerinin PC boyunca ticaretini test etmeye izin verir, GPR161 normalde PC'den çıkarken GLI2 ve SMO, SHH yol aktivasyonuna yanıt olarak PC içinde birikir (Şekil 2C-D). CiliaQ araçları kullanılarak 3D konfokal görüntü yığınlarının analizi, SHH yol aktivasyonundan sonra PC'den GPR161 çıkışının yanı sıra PC içindeki GLI2 ve SMO birikiminin ölçülmesine olanak tanır (Şekil 2F-G). Ek olarak, rSHH veya SAG ile işlenmiş NSPC'lerden çıkarılan mRNA üzerindeki yarı nicel RT-PCR analizi, kontrol hIPSC'lerinden elde edilen NSPC'lerde normal SHH sinyal transdüksiyonunu kanıtlayan gli1 ve PTCH1 adlı iki SHH hedef geninin indüksiyonunu göstermektedir (Şekil 2B).

Genel olarak, dorsal forebrain geliştirmenin 2D hücre tabanlı modelleri, normal serebral korteks gelişiminin çeşitli yönlerini açıkça yeniden üretir ve beyin korteksinin insan gelişimsel anomalilerinden sorumlu genlerde mutasyonları barındıran hasta hIPSC'lere karşı kontrol kullanarak neokortik gelişimin altında bulunan PC ile ilişkili mekanizmaları parçalamak için umut verici araçları temsil eder.

Neokortik gelişim sırasında primer sezyum tutulumlarını incelemek için 3D hIPS hücre bazlı modeller
Burada açıklanan protokol (Şekil 3A) daha önce yayınlanan protokollerden uyarlanmıştır23,24,25,26,30 ve beş ayrı kontrol hIPSC hattında başarıyla test edilmiştir. Büyük nöroepithelial döngüler oluştururken zamanla büyüklüğü artan hIPSC türevi dorsal forebrain organoidlerinin üretilmesine izin verir (Şekil 3B). İmmün etiketleme analizi ya organoid kriyoseksiyonlar (kriyostat, 20 μm), serbest yüzen bölümler (vibratom, 150 μm) veya toto, kalite kontrolleri için yapılabilir. 28 ± 2. günde organoidler, nöral progenitör belirteci SOX2 ve dorsal forebrain belirteci PAX6'yı birlikte ifade eden ve dorsal forebrain kimliğini kanıtlayan tabakalı nöroepithelial döngülerden oluşur. 42 ± 2 (6 haftalık farklılaşma) gününde, bu döngüler daha karmaşık bir tabakalı organizasyon göstermelidir. Apikalden bu döngü yapılarının bazal yüzeyine kadar, SOX2/PAX6 pozitif apikal radyal progenitörlere (aRG) sahip ventrikül bölgesi (VZ) benzeri bir bölgenin yanı sıra TBR2 pozitif ara progenitörlere (IPs) sahip subventriküler bölge (SVZ) benzeri bir bölge ve CTIP2 pozitif erken doğan neokortik nöronlar içeren kortikal plaka (CP) benzeri bir bölge (Şekil 3C, E). ARG'nin apikal moleküler polaritesi ZO-1 ve N-CADH'nin ventrikül yüzeyindeki apikal zenginleştirme ile değerlendirilebilir (Şekil 4A, Video 1). ARG progenitör bölme özellikleri, normalde kortikal döngülerin ventrikül yüzeyinde aRG mitotik çekirdeklerinin hizalanmasına yol açan INM'yi analiz etmek için TP2X ve P-VIM belirteçleri kullanılarak değerlendirilebilir (Şekil 4B, Video 2). Bu tür immünolabeling, aRG'nin simetrik ve asimetrik bölme modunu değerlendirmek için bölme açısının ölçülenini de sağlar. P-Vim pozitif ataları SVZ benzeri bölgede de gözlenebilir ve dış radyal gliayı andıran bazal yüzeye uzanan benzersiz bir bazal süreci barındırır (oRG veya bazal radyal glia, Şekil 4C, Video 2). 42. günden itibaren yok olsalar da, SATB2 pozitif geç doğan nöronlar 70. günden itibaren tespit edilmelidir (Şekil 3D, F), neokortik nöronal farklılaşmanın in vivo benzeri zamanlamasını doğrular.

Bazal gövde (gama Tubulin) ve aksononme (ARL13B) belirteçlerini kullanan immünolabeling deneyleri, PC'nin 20 μm kriyoeksiyonda görselleştirilmesine izin verir (Şekil 3G, H). Dorsal forebrain organoidlerinin 3D organizasyonundan yararlanmak için tüm montajlı immünostainleme yapılabilir. Toto immünostained ve temizlenmiş organoidlerde bu tür ışık tabakası alımı, tüm NSPC tiplerinde ve neokortik nöronlarda hem centrozomların hem de PC'nin tespit edilmesine izin verir (Video 3). Ayrıca PC biyogenezinin daha doğru analizlerini yapmak için serbest yüzen kalın bölümlerde (150 μm) dorsal forebrain organoid üzerinde immünhistokimya analizi yapılabilir. Temizlendikten sonra, bu tür bölümler, organoidlerin 3D uzamsal bilgilerini korurken çözünürlüğü iyileştirmeye izin vererek ters rezonanslı beyaz ışık konfokal lazer mikroskopunun 40x (NA 1.3) veya 63x (NA 1.4) yağ hedefi kullanılarak edinilebilir. Bu tür lazer tarama konfokal mikroskop, herhangi bir parazit olmadan hassas ve esnek bir heyecan ve algılama ile kalın bölümlerin hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar (Video 4). 3D görüntüleme yazılımı kullanılarak PC numarası, uzunluğu ve yönü de dahil olmak üzere pc'nin çeşitli yapısal parametreleri değerlendirilebilir. Makine öğrenimi tabanlı bir görüntü analiz aracı olan Ilastik28 ve Fiji/ImageJ29'daki CiliaQ eklenti paketi gibi özel açık kaynaklı, serbestçe kullanılabilen araçlar, PC biyogenezinin ve fonksiyonunun patolojik koşullara karşı kontrol altında daha sonra nitel ve nicel analizine izin vererek otomatik PC segmentasyonu için son derece yararlıdır.

Figure 1
Şekil 1: 2D nöral rozetlerin üretimi ve karakterizasyonu. AP'yi tespit etmek için (A) SOX2 ve PAX6 antikorları kullanılarak nöral rozet yapılarının immünohistokimyasal karakterizasyonu, IP'yi ortaya çıkarmak için (B) TBR2/EOMES ve erken doğan neokortik nöronları lekelendirmek için (C) CTIP2. Çoğalma AP fosfo-vimentin ve TPX2 antikorları ile tespit edilir ve apikal yüzeyde (D,D') bulunur. PCNT ve ARL13B antikorları ile çift immünostainasyon ile PC ortaya çıkar. PC her AP'den her rozetin merkezi lümenine uzanırken, IP ve erken doğan nöronlarda da tespit edilir (E,E', E''). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 2D nöral rozetlerden elde edilen izole NSPC'ler fonksiyonel PC barındırır. 2D-nöral rozetlerin ayrışması, ARL13B ve PCNT immünostaining (A) tarafından ortaya çıkarıldığı gibi 48 saat açlık sonrası PC'yi barındıran izole NSPC'lere yol açar. NSPC'ler, 48 saat aç kaldıktan sonra gli1 ve PTCH1 adlı iki SHH hedef geninin RT-PCR nicelemesi ve daha sonra 24 h için rekombinant SHH (rSHH) ile tedavi ile yolun aktivasyonu ile ortaya çıkan fonksiyonel PC'yi barındırır. Veriler 2−ΔΔCt yöntemi ile analiz edildi ve SEM (Mann Whitney testi) (B) ± göreli ifade olarak sunuldu. SHH yol aktivasyonundan sonra sırasıyla PC'de biriken veya çıkan SHH sinyal yolunun iki önemli aktörü gli2 ve GPR161'in dinamiklerini test etmek için (D) veya (C) rSHH tedavisi olmayan aç NSPC'ler üzerinde IF analizi. Konfokal görüntülerin analizi için Ilastik ve CiliaQ araçları birleştirilerek, PC içindeki GPR161 (F) ve GLI2 (G) sinyal yoğunluğu +/- rSHH tedavi edilen NSPC'lerde karşılaştırıldı. PC segmentasyonu için ARL13B boyama kullanıldı ve beklendiği gibi PC uzunluğu +/- rSHH tedavi edilen NSPC'lerde (E) değişmedi. Veriler kutu ve yatay çizgi çizimlerinde özetlenir (SEM ± ortalama değerler). s < 0.0001 (Mann Whitney testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Dorsal forebrain organoidlerinin üretimi ve karakterizasyonu. (A) Dorsal forebrain organoidleri oluşturmak için protokole şematik genel bakış. (B) 1, 3, 7, 24 ve 42. SOX2 ile immünostainasyondan sonra 42 (C) ve 70 (D) gün organoidlerinin 20 μm kriyoseksiyonunun konfokal görüntüleri, TBR2 ve CTIP2 antikorları sırasıyla, ventrikül bölgesi (VZ), TBR2 pozitif IP içeren subventriküler bölge (SVZ) ve CTIP2 pozitif erken doğan neokortik nöronları içeren ön plaka benzeri bölge (CP). PAX6, CTIP2 ve SATB2 antikorları ile immünostainasyondan sonra 42 (E) ve 70 (F) gün organoidlerin 20 μm kriyoseksiyonunun konfokal görüntüleri, 70. ARL13B ve PCNT antikorları ile immünostainasyondan sonra 42. günde bir organoidin 20 μm kriyoseksiyonunun konfokal görüntüleri, radyal glial progenitörlerin (G) apikal kutbunda PC'yi ortaya çıkarırken, CTIP2 pozitif nöronlarda (H) da bulunurlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Dorsal forebrain organoidlerinin 3D görüntülenmesi. (A) PAX6 ile boyanmış tüm bir sırt ön beyin organoidinin (Gün 42) ışık tabakası kazanımı, N-CADH ve CTIP2 antikorları PAX6 pozitif radyal glial progenitörler ile çoklu nöroepithelial döngüleri gösteren doğru apikobakal polarite gösteren N-Cadherin'in apikal yanlarında birikmesi ve CTIP2 pozitif erken doğan neokortik nöronların ön plaka benzeri bir bölgeyi işaret ettiği gibi. (B) Ventriküler radyal glial progenitörlerin interkinetik nükleer göçünü gösteren TPX2, P-Vim ve CTIP2 antikorları ile boyanmış tüm dorsal forebrain organoidinin (Gün 42) ışık tabakası alımı. (C) TPX2 ve P-Vim antikorları ile boyanmış, benzersiz bir bazal süreci uzatan ve dış radyal glial progenitor'u andıran subventriküler bölgede lokalize olan tüm bir dorsal forebrain organoidinin (Gün 42) ışık tabakası alımını yakınlaştırın. (D) Rezonans Tarayıcı, NSPC'lerde ve neokortik nöronlarda PC GÖSTEREN PCNT ve ARL13B antikorları ile lekelenmiş bir dorsal forebrain organoidinin 150 μm bölümünün (Gün 42) edinimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Serebral kortikal anomalilerin patofizyolojisine PC tutulumunu ortadan kaldırmak için dorsal ön beyin gelişiminin 2D ve 3D hIPS hücre bazlı modellerinin üretilmesi ve karakterizasyonu. hIPS hücrelerinin embriyoid cisimleri (EBs) düşük yapışma kültürü plakalarına oluşturmasına izin verilir ve daha sonra nöroektodermal farklılaşmayı teşvik etmek için çift SMAD inhibitörleri içeren bir indüksiyon ortamına inkübe edilir. EBs'lerin PO/lam kaplı yemeklere yapışması, 2D nöral rozet yapılarının üretilmesine izin verirken, DAHA sonra BMM'ye gömülmesi ile ES'lerin serbest yüzen kültürü dorsal ön beyin organoidlerinin üretilmesine izin verir. Mitojenik faktörlerin yapışan nöral rozet ortamından çekilmesi, IF analizi ile test edilebilen nörogenez başlangıcını teşvik eder. Yapışan nöral rozetlerin ayrışması, PC biyogenez ve fonksiyon analizi için yararlı izole NSPC kültürlerinin üretilmesini sağlar. Dorsal forebrain organoidleri 4, 6 veya 10 haftalık farklılaşmadan sonra toplanır ve daha sonra immünostainasyon analizi için toto, 150 μm kalınlığında bölümlerde veya 20 μm kriyoeksiyonda sabitlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: PAX6, CTIP2 ve NCADH antikorları ile bağışıklık kazanılan tüm dorsal forebrain organoidinin (Gün 42) ışık tabakası kazanımı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2: TPX2, P-VIM ve CTIP2 antikorları ile bağışıklık kazanılan tüm dorsal forebrain organoidinin (Gün 42) ışık tabakası kazanımı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 3: PCNT ve ARL13B antikorları ile bağışıklık kazanılan tüm dorsal forebrain organoidinin (Gün 42) ışık tabakası kazanımı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 4: ARL13B ve PCNT antikorları ile bağışıklık kazanılmış bir dorsal forebrain organoidinin (42. gün) 150 μm'lik bir bölümünün rezonans tarama konfokal alımı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

EK DOSYALAR: Tabloları indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1: 2D-nural rozet ve NSPC'lerin üretimi için kullanılan ortamın tarifi.

Ek Tablo 2: Dorsal forebrain organoidlerinin üretimi için kullanılan ortamın tarifi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PC artık normal serebral kortikal gelişim sırasında önemli adımları düzenleyen önemli organeller olarak kabul edilmektedir18,19,31 NSPC genişlemesi ve taahhüdü8,9,10,11,12 yanı sıra nöronal göç13,14 ve synaptogenesis16,17 dahil . Hayvan modellerinde veya insan fetal serebral dokularında analize ek olarak, hem normal hem de patolojik serebral kortikal gelişim sırasında PC'nin rolünün incelenmesi için son derece yenilikçi ve ilgili hasta kaynaklı hIPSC tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretilmesi esastır.

Burada ayrıntılı olarak açıklanan 2D hIPSC tabanlı modelleme protokolü üç büyük yayından uyarlandı20,21,22. Nöroepithelial farklılaşma, aktivin/nodal (SB-431542) ve BMP (LDN-193189) yollarının küçük molekül inhibitörleri kullanılarak çift SMAD inhibisyonu ile indüklenmiştir22. Hücreler, 20 günlük farklılaşmadan sonra NSPC'lerin yanı sıra neokortik derin tabaka nöronlarını içeren rozet şeklindeki yapılarda düzenlenir. Ek olarak, bu rozet benzeri yapılar doğru apikobasal polarite, apikal progenitörlerin interkinetik nükleer göçü ve tüm NSPC'lerden ve nöronlardan uzanan PC göstermektedir. Bu rozet yapılarının ayrışması sonrasında homojen ve istikrarlı bir kortikal progenitör popülasyonu elde edilir21. Bir araya gelmek için kültürlendiğinde ve 48 saat aç kaldığında, bu kortikal atalar, Morfoloji, sayı ve uzunluğun Fiji / ImageJ'de Ilastik28 ve CiliaQ28,29 eklenti paketini birleştirerek kolayca analiz edilebildiği PC'yi barındırır. Ayrıca, SHH sinyal yolunu indük etmek için sitokinler kullanılarak, PC işlevi IF tarafından GLI2, SMO ve GPR161 gibi PC boyunca önemli sinyal yolu aktörlerinin dinamiklerini test etmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, yarı nicel RT-PCR tahlilleri, SHH yol aktivasyonuna yanıt olarak GLI1 ve PTCH1 de dahil olmak üzere SHH hedef gen ekspresyonunun indüksiyonunun test edilmesini sağlar. WNT ve IGF yolları2,32,33 dahil olmak üzere PC işlevine bağlı diğer sinyal yolları da test edilmelidir. Normal serebral korteks gelişiminin çeşitli yönlerini açıkça yeniden üreten bu 2D modelleme yaklaşımına karar vermek için, PC biyogenezini ve işlevini normal ve patolojik koşullarda test etmek için yararlı ve ilgili bir aracı temsil eder ve neokortik gelişim sırasında PC'nin katılımı hakkında daha fazla bilgi edinmeye katkıda bulunmalıdır.

2D hIPSC tabanlı modelleme yaklaşımlarının tamamlayıcısı olan dorsal forebrain organoidler, erken gelişen insan serebral korteksinin birçok özelliğini ve özelliğini yeniden özetledikleri için normal ve patolojik serebral gelişimi in vitro olarak araştırmak için eşi görülmemiş fırsatlar sunar. Şu anda iki ana protokol türü kullanılmaktadır: içsel ve kılavuzlu yöntemler. Lancaster ve meslektaşları tarafından geliştirilen içsel protokol23, IPSC'lerin minimum dış faktörle kendi kendine organize olma içsel yeteneğine dayanır ve farklı beyin bölgeleri arasındaki etkileşimleri modellemek için benzersiz bir fırsat sunan farklı beyin bölgelerinin temellerini içeren serebral organoidlere yol açar. Bununla birlikte, bu tür modelleme stratejisinin doğasında bulunan yüksek değişkenlik ve heterojenlik, tekrarlanabilirliğin önemli zorluklarını ortaya beklemektedir. Kılavuzlu organoid farklılaşma protokolleri, beyin bölgesine özgü organoidlerin minimal heterojenite ile üretilmesine izin verir24,25,26. Bu yaklaşım, erken insan serebral kortikal gelişiminin ana süreçlerini yeniden sağlayan ventrikül benzeri yapılarla dorsal forebrain organoidlerini başarılı bir şekilde üretmemizi sağladı. İlk kritik konu, %10'dan daha az farklılaşma gösteren ve hIPC'leri tek hücreli kültür koşullarına uyarlamak için neredeyse bir kez monolayer olarak geçirilen büyük düzenli kolonileri barındıran yüksek kaliteli hIPSC kültürleriyle başlamaktır. Gerçekten de, alandaki en büyük zorluklardan biri olan organoid heterojenliği sınırlamak için, homojen bir boyuta sahip EBs oluşumu, hIPSC kolonilerinin tanımlanan hücre yoğunluğunda tohumlanmaya izin veren tek hücreli süspansiyona ayrışması ihtiyacını ima eden bir ön koşuldur. Bir diğer kritik adım, 3D yapıyı ve nöroepithelial genişlemeyi desteklemek için gereken EBs'nin BMM dahil edilmesidir. Ek bir adım, BMM ayrışması içerse bile, yaklaşık on beş organoidin gruba dahil edilmesini bireysel içerme yerine tercih ettik. Sallama kültüründen önceki BMM ayrışmasının organoid partiler içinde ve arasında değişkenliği azalttığı ve böylece daha yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuçladığı gösterilmiştir34. Ek olarak, aşağıdaki farklılaşma adımları için zararlı olmayan ancak prosedürün sonraki adımları sırasında kalite kontrolü için organoidlerin gözlemlenmesini zorlaştıran BMM'ye uzanan hücre işlemlerinden kurtulmaya izin verir. Beslenme emilimini ve oksijen değişimini iyileştirmek için, benzer sonuçlara yol açan yörüngesel çalkalayıcılar ve dönen biyoreaktörler üzerinde organoid olgunlaşmayı karşılaştırdık. Bu nedenle, orta hacimleri ve dolayısıyla deneylerin toplam maliyetini önemli ölçüde azaltmaya izin verdiği için yörüngesel çalkalayıcı seçeneğini seçtik. Daha da önemlisi, hIPSC büyümesine zarar verici titreşimleri önlemek için yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde sabit ve sallama kültürü için farklı bir inkübatör kullanın. Bu protokolü, bu prosedürün sağlamlığını sağlayan homojen sonuçlara yol açan beş ayrı kontrol hIPSC hattı35'te başarıyla uyguladık.

Bu tür organoidlerin karakterizasyonu çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Organoidler içindeki 3D mekansal bilgileri korumak için, sonraki ışık tabakası alımı ile tüm organoidlerin tamamen monte immünostaining ve temizlenmesine izin sağlayan bir protokol kurduk. Numune menşei ve kalınlığına bağlı olarak verimlilikle farklı takas yöntemleri ortaya çıkmıştır36,37. Burada, daha önce fare beynini ve bağırsak organoidlerini temizlemek için kullanılan glikol türevi olan TDE'ye (2,2'-tiyodiethanol) dayanan basit, hızlı ve uygun maliyetli bir temizleme yöntemi kurduk38,39. İmmün olarak tespit edilmiş ve temizlenmiş organoidlerin edinimi, %80 TDE'ye batırılmış 20x hedefi kullanılarak bir ışık tabakası mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Diğer 3D görüntüleme alma yöntemlerine kıyasla, ışık tabakası mikroskopisi çeşitli nedenlerden dolayı ilgi çekicidir: hızlı edinme, iyi penetrasyon ve azaltılmış fotobleaching. Permeabilizasyon adımının optimizasyonu, tüm organoidin tüm progenitör ve nöronal hücre türlerinden uzanan BAZAL cisimleri ve PC akonemlerini görselleştirmeye izin vererek verimli ve homojen antikor penetrasyonuna ulaşmayı sağlar. Ayrıca, 40x (NA 1.3) veya 63x (NA 1.4) yağ hedeflerine sahip ters rezonans tarama konfokal mikroskobu kullanılarak serbest yüzen 150 μm kalınlığında bölümlerin edinimi, önemli ölçüde 3D mekansal bilgiyi korurken ve PC biyogenezinin ve işlevinin nitel ve nicel analizine izin verirken, çözünürlüğe daha fazla katkıda bulunmasını sağlar.

Bu tür 2D ve 3D hücre tabanlı modellerin ve 3D görüntüleme analizinin (Şekil 5) ciliopati hasta hücrelerinin yeniden programlanması veya crispr/CAS9 teknolojisinin özellikle centrosomal veya silier genleri düzenlemek için kullanılmasıyla oluşturulan hIPSC'lerde birleştirilmesi, serebral korteksin normal ve patolojik gelişimi sırasında PC'nin katkısının anlaşılmasında önemli ilerlemeler sağlanmalıdır. Daha da önemlisi, genom düzenleme teknolojisi, hastalık mekanizmalarının tespitine meydan okuyan genetik heterojenliğin üstesinden gelmek için izojenik kontrol hIPSC'leri elde etmek için hasta mutasyonlarını özellikle kurtarmayı da sağlar. Buna ek olarak, tek hücreli genomik yaklaşımlar artık tüm alanda yaygın olarak kullanılmaktadır ve immünostaining analizine ilgili ve tamamlayıcı yaklaşımları temsil eder. Bu nedenle, gelişmekte olan tüm teknolojilerin doğasında bulunan ve kapsamlı bir şekilde ele alınan bazı sınırlamalara ve zorluklara rağmen, bu tür 2D ve 3D hIPSC tabanlı modeller ve burada sunduğumuz karakterizasyon yöntemleri, PC katılımını insan gelişimsel neokortik anomalilerinin altında bulunan patolojik mekanizmalara dahil etmek için güçlü ve ilgili araçlar sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

Bu çalışma Agence Nationale de la Recherche'den (ANR) S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) ve N.B.B.'ye (ANR-16-CE16-0011 ve ANR-19-CE16-0002-01) verilen hibelerle desteklendi. LB, Investissements d'avenir programı (ANR-10-IAHU-01) ve Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD programı) altında ANR tarafından desteklenmektedir. Imagine Enstitüsü, Investissements d'avenir programı (ANR-10-IAHU-01, CrossLab projeleri) ve ikinci Investissements d'Avenir programının (ANR-17-RHUS-0002) bir parçası olarak ANR'den devlet finansmanı ile desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 181 primer siçyum insan kaynaklı pluripotent kök hücreler hIPSC'ler nöral kök ve progenitör hücreler insan serebral kortikal gelişimi nöral rozetler dorsal forebrain organoidleri 2D ve 3D hIPSC tabanlı neokortik gelişim modelleri serebral organoidler Sonic kirpi tüm montajlı immünostaining optik temizleme ışık mikroskobu
Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter