2D og 3D Human induserte Pluripotente stamcellebaserte modeller for å dissekere primær ciliuminvolvering under neokortisk utvikling
Summary
Vi presenterer detaljerte protokoller for generering og karakterisering av 2D og 3D human indusert pluripotent stamcelle (hIPSC)-baserte modeller for neokortisk utvikling samt komplementære metoder som muliggjør kvalitativ og kvantitativ analyse av primær cilium (PC) biogenese og funksjon.
Abstract
Primær cilia (PC) er ikke-motile dynamiske mikrotubulebaserte organeller som stikker ut fra overflaten av de fleste pattedyrceller. De kommer ut av den eldre sentriolen under G1/G0-fasen av cellesyklusen, mens de demonteres når cellene går inn i cellesyklusen ved G2/M-fasegrensen igjen. De fungerer som signalhuber, ved å oppdage og transdusere ekstracellulære signaler som er avgjørende for mange celleprosesser. I likhet med de fleste celletyper har alle neokortiske nevrale stamme- og stamceller (NSPCer) vist seg å ha en PC som gjør at de kan føle og transdusere spesifikke signaler som kreves for den normale cerebral kortikale utviklingen. Her tilbyr vi detaljerte protokoller for å generere og karakterisere todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) cellebaserte modeller fra menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSCer) for å ytterligere dissekere involvering av PC under neokortisk utvikling. Spesielt presenterer vi protokoller for å studere PC-biogenesen og funksjonen i 2D nevrale rosett-avledede NSPCer, inkludert transduksjon av Sonic Hedgehog (SHH) -banen. For å dra nytte av den tredimensjonale (3D) organiseringen av cerebral organoider, beskriver vi en enkel metode for 3D-avbildning av i toto immunosterte cerebral organoider. Etter optisk rydding tillater rask oppkjøp av hele organoider påvisning av både sentrosomer og PC på neokortiske forfedre og nevroner i hele organoiden. Til slutt beskriver vi prosedyren for immunstaining og rydding av tykke frittflytende organoide seksjoner som bevarer en betydelig grad av 3D-romlig informasjon og tillater høyoppløselig oppkjøp som kreves for detaljert kvalitativ og kvantitativ analyse av PC-biogenese og funksjon.
Introduction
Primær cilia (PC) er mikrotubule-baserte organeller som sanser og transduserer en mengde kjemiske og mekaniske signaler fra det ekstracellulære miljøet. Spesielt er PC den sentrale organellen for transduksjon av Hedgehog-signalveien i vertebrater1,2. Mens de fleste nevrale celler lenge har blitt vist å huse en PC, har bidraget fra denne organellen i å forme sentralnervesystemet lenge vært undervurdert. Studier på neokortisk utvikling har ført til oppdagelsen av flere nevrale stamme- og stamceller (NSPCer), som alle har en PC, hvorav plasseringen er foreslått å være avgjørende for forfederens skjebnebestemmelse3,4,5,6,7. PC har vist seg avgjørende for cellemekanismer som kreves for normal cerebral kortikale utvikling, inkludert NSPC-utvidelse og engasjement8,9,10,11,12 samt apicobasal polaritet av radial glial stillas som støtter nevronal migrasjon13. I tillegg kreves PC under interneurons tangentielle migrasjon til kortikale plate14,15. Til slutt har det blitt foreslått en rolle for PCen i etableringen av synaptiske forbindelser av nevroner i hjernebarken16,17. Til sammen argumenterer disse funnene for en avgjørende rolle for PC på store trinn i cerebral kortikale utvikling18,19 og øker behovet for å undersøke deres engasjement i de patologiske mekanismene som ligger til grunn for anomalier av cerebral kortikale utvikling.
Nyere studier har i stor grad forbedret vår forståelse av viktige cellulære og molekylære forskjeller mellom kortikale utvikling i menneskelige og dyremodeller, med vekt på behovet for å utvikle menneskelige modellsystemer. I dette synet representerer menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSCer) en lovende tilnærming til å studere sykdomspatogenese i en relevant genetisk og cellulær kontekst. Tilhenger todimensjonale (2D) cellebaserte modeller eller nevrale rosetter inneholder NSPCer som ligner de som er sett i den utviklende hjernebarken, som blir organisert i rosettformede strukturer som viser riktig apicobasal polaritet20,21,22. Videre tillater det tredimensjonale (3D) kultursystemet generering av dorsale forebrain organoider som rekapitulerer mange trekk ved menneskelig cerebral kortikale utvikling23,24,25,26. Disse to komplementære cellebaserte modelleringsmetodene gir spennende perspektiver for å dissekere involvering av PC under normal og patologisk utvikling av hjernebarken.
Her tilbyr vi detaljerte protokoller for generering og karakterisering av nevrale rosetter og avledede NSPCer samt dorsale forebrain organoider. Vi tilbyr også detaljerte protokoller for å analysere biogenesen og funksjonen til PC som er tilstede på NSPCer ved å teste transduksjonen av Sonic Hedgehog-banen og analysere dynamikken til viktige molekyler involvert i denne veien. For å dra nytte av 3D-organiseringen av cerebral organoider, setter vi også opp en enkel og kostnadseffektiv metode for 3D-avbildning av in toto immunosterte cerebral organoider som tillater rask oppkjøp, takket være et lysarkmikroskop, av hele organoiden, med høy oppløsning som gjør det mulig å visualisere PC på alle typer neokortiske forfedre og nevroner av hele organoidet. Til slutt tilpasset vi immunhiistokjemi på 150 μm frittflytende seksjoner med etterfølgende rydding og oppkjøp ved hjelp av resonansskanning konfektmikroskop som tillater høyoppløselig bildeanskaffelse, som kreves for detaljert analyse av PC-biogenese og funksjon. Spesielt tillater 3D-bildebehandlingsprogramvare 3D-rekonstruksjon av PC med etterfølgende analyse av morfologiske parametere, inkludert lengde, antall og orientering av PC, samt signalintensitetsmåling av ciliary komponenter langs axoneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
PC er nå ansett som viktige organeller som regulerer viktige skritt under normal cerebral kortikale utvikling18,19,31 inkludert NSPC-utvidelse og engasjement8,9,10,11,12 samt nevronal migrasjon13,14 og synapt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Agence Nationale de la Recherche (ANR) til S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) og N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 og ANR-19-CE16-0002-01). LB støttes av ANR under Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01) og Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-programmet). Imagine Institute støttes av statlig finansiering fra ANR under Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-prosjekter) og som en del av det andre Investissements d’Avenir-programmet (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
