Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical
Summary
Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).
Abstract
Los cilios primarios (PC) son orgánulos dinámicos no móviles basados en microtúbulos que sobresalen de la superficie de la mayoría de las células de mamíferos. Emergen del centriolo más antiguo durante la fase G1/G0 del ciclo celular, mientras que se desmontan a medida que las células vuelven a entrar en el ciclo celular en el límite de la fase G2/M. Funcionan como centros de señales, detectando y transduciendo señales extracelulares cruciales para muchos procesos celulares. Al igual que en la mayoría de los tipos de células, se ha demostrado que todas las células madre y progenitoras neurales neocorticales (NSPC) albergan una PC que les permite detectar y transducir señales específicas requeridas para el desarrollo cortical cerebral normal. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para generar y caracterizar modelos bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) basados en células a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) para diseccionar aún más la participación de la PC durante el desarrollo neocortical. En particular, presentamos protocolos para estudiar la biogénesis y la función de la PC en NSPC derivados de rosetas neuronales 2D, incluida la transducción de la vía Sonic Hedgehog (SHH). Para aprovechar la organización tridimensional (3D) de los organoides cerebrales, describimos un método simple para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos. Después de la limpieza óptica, la rápida adquisición de organoides completos permite la detección de centrosomas y PC en progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, detallamos el procedimiento para la inmunotinción y limpieza de gruesas secciones organoides que flotan libremente, preservando un grado significativo de información espacial 3D y permitiendo la adquisición de alta resolución requerida para el análisis cualitativo y cuantitativo detallado de la biogénesis y la función de la PC.
Introduction
Los cilios primarios (PC) son orgánulos basados en microtúbulos que detectan y transducen una gran cantidad de señales químicas y mecánicas del entorno extracelular. En particular, la PC es el orgánulo central para la transducción de la vía de señalización del erizo en vertebrados1,2. Si bien se ha demostrado durante mucho tiempo que la mayoría de las células neuronales albergan una PC, la contribución de este orgánulo en la configuración del sistema nervioso central ha sido subestimada durante mucho tiempo. Los estudios sobre el desarrollo neocortical han llevado al descubrimiento de múltiples células madre y progenitoras neurales (NSPC), todas albergando una PC, cuya ubicación se ha propuesto que es crucial para la determinación del destino de los progenitores3,4,5,6,7. La PC ha demostrado ser crucial para los mecanismos celulares que se requieren para el desarrollo cortical cerebral normal, incluida la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la polaridad apicobasal del andamio glial radial que apoya la migración neuronal13. Además, se requieren PC durante la migración tangencial de las interneuronas a la placa cortical14,15. Finalmente, se ha propuesto un papel para el PC en el establecimiento de conexiones sinápticas de neuronas en la corteza cerebral16,17. En conjunto, estos hallazgos abogan por un papel crucial de la PC en los principales pasos del desarrollo cortical cerebral18,19 y plantean la necesidad de investigar su participación en los mecanismos patológicos subyacentes a las anomalías del desarrollo cortical cerebral.
Estudios recientes han mejorado en gran medida nuestra comprensión de las importantes diferencias celulares y moleculares entre el desarrollo cortical en modelos humanos y animales, enfatizando la necesidad de desarrollar sistemas modelo humanos. Desde este punto de vista, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) representan un enfoque prometedor para estudiar la patogénesis de la enfermedad en un contexto genético y celular relevante. Los modelos adherentes bidimensionales (2D) basados en células o rosetas neuronales contienen NSPC similares a los observados en la corteza cerebral en desarrollo, que se organizan en estructuras en forma de roseta que muestran una polaridad apicobasal correcta20,21,22. Además, el sistema de cultivo tridimensional (3D) permite la generación de organoides del cerebro anterior dorsal que recapitulan muchas características del desarrollo cortical cerebral humano23,24,25,26. Esos dos enfoques complementarios de modelado basado en células ofrecen perspectivas emocionantes para diseccionar la participación de la PC durante el desarrollo normal y patológico de la corteza cerebral.
Aquí, proporcionamos protocolos detallados para la generación y caracterización de rosetas neurales y NSPC derivados, así como organoides del cerebro anterior dorsal. También proporcionamos protocolos detallados para analizar la biogénesis y la función de la PC presente en los NSPC mediante la prueba de la transducción de la vía Sonic Hedgehog y el análisis de la dinámica de moléculas cruciales involucradas en esta vía. Para aprovechar la organización 3D de los organoides cerebrales, también establecimos un método simple y rentable para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos que permiten una rápida adquisición, gracias a un microscopio de lámina de luz, de todo el organoide, con alta resolución que permite visualizar PC en todo tipo de progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, adaptamos la inmunohistoquímica en secciones de flotación libre de 150 μm con posterior limpieza y adquisición utilizando microscopio confocal de barrido resonante que permite la adquisición de imágenes de alta resolución, que se requiere para el análisis detallado de la biogénesis y la función de la PC. Específicamente, el software de imágenes 3D permite la reconstrucción 3D de PC con el análisis posterior de parámetros morfológicos que incluyen longitud, número y orientación de PC, así como la medición de la intensidad de la señal de los componentes ciliares a lo largo del axonema.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la actualidad, los PC se consideran orgánulos clave que regulan pasos cruciales durante el desarrollo cortical cerebral normal18,19,31 incluyendo la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la migración neuronal13,14<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) y N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 y ANR-19-CE16-0002-01). LB cuenta con el apoyo de la ANR en el marco del programa Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) y la Fondation Bettencourt Schueller (programa MD-PhD). El Imagine Institute cuenta con el apoyo de fondos estatales de la ANR en el marco del programa Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, proyectos CrossLab) y como parte del segundo programa Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
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