2D- och 3D-mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade modeller för att dissekera primärt ciliuminblandning under neokortisk utveckling
Summary
Vi presenterar detaljerade protokoll för generering och karakterisering av 2D och 3D mänskliga inducerad pluripotent stamcell (hIPSC)-baserade modeller av neokortikal utveckling samt kompletterande metoder möjliggör kvalitativ och kvantitativ analys av primära cilium (PC) biogenes och funktion.
Abstract
Primära cilia (PC) är icke-motila dynamiska mikrotubule-baserade organeller som sticker ut från ytan av de flesta däggdjursceller. De kommer ut ur den äldre centriole under G1/G0-fasen av cellcykeln, medan de demonteras när cellerna återinträder i cellcykeln vid G2/M-fasgränsen. De fungerar som signalnav genom att upptäcka och omvandla extracellulära signaler som är avgörande för många cellprocesser. I likhet med de flesta celltyper har alla neokortikala neurala stam- och stamceller (NSPCs) visat sig hysa en dator så att de kan känna av och transleda specifika signaler som krävs för den normala cerebrala när utvecklingen. Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för att generera och karakterisera tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) cellbaserade modeller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hIPSCs) för att ytterligare dissekera pc: s engagemang under neokortisk utveckling. I synnerhet presenterar vi protokoll för att studera PC biogenesis och funktion i 2D neural rosett-härledda NSPCs inklusive transduktion av Sonic Hedgehog (SHH) vägen. För att dra nytta av den tredimensionella (3D) organisationen av cerebrala organoider, beskriver vi en enkel metod för 3D imaging av in toto immunstained cerebrala organoider. Efter optisk clearing, snabb förvärv av hela organoider möjliggör detektion av både centrosomer och PC på neokortikala stamceller och nervceller av hela organoiden. Slutligen beskriver vi förfarandet för immunstaining och clearing av tjocka fritt flytande organoid avsnitt bevara en betydande grad av 3D rumslig information och möjliggöra den högupplösta förvärv som krävs för detaljerad kvalitativ och kvantitativ analys av PC biogenes och funktion.
Introduction
Primära cilia (PC) är mikrotubule-baserade organeller som känner av och omvandlar en mängd kemiska och mekaniska signaler från den extracellulära miljön. Pc är särskilt den centrala organellen för transduktion av igelkottsignalvägen hos ryggradsdjur1,2. Medan de flesta neurala celler länge har visats hysa en dator, har bidraget från denna organell i att forma centrala nervsystemet länge varit undervärderat. Studier på neokortikisk utveckling har lett till upptäckten av flera neurala stamceller och stamceller (NSPCs), som alla hyser en dator, vars plats har föreslagits vara avgörande för föregångarens ödesbestämning3,4,5,6,7. PC har visats avgörande för cell mekanismer som krävs för normala cerebrala när utveckling, inklusive NSPC expansion och engagemang8,9,10,11,12 samt apicobasal polaritet av radiell glia ställning stödja neuronal migration13. Dessutom krävs PC under interneurons tangentiell migrering till den närplattan14,15. Slutligen har en roll för pc föreslagits i upprättandet av synaptiska anslutningar av nervceller i hjärnbarken16,17. Sammantaget argumenterar dessa resultat för en avgörande roll av PC vid stora steg av cerebrala när utveckling18,19 och höja behovet av att undersöka deras engagemang i de patologiska mekanismerna bakom anomalier av cerebrala när utveckling.
Nyligen genomförda studier har till stor del förbättrat vår förståelse av viktiga cellulära och molekylära skillnader mellan när utveckling i mänskliga och animaliska modeller, med betoning på behovet av att utveckla mänskliga modellsystem. I detta synsätt representerar human inducerade pluripotenta stamceller (hIPSCs) ett lovande tillvägagångssätt för att studera sjukdom patogenes i ett relevant genetiskt och cellulärt sammanhang. Vidhäftande tvådimensionella (2D) cellbaserade modeller eller neurala rosetter innehåller NSPCs som liknar de som ses i den utvecklande hjärnbarken, som blir organiserade i rosettformade strukturer som visar korrekt apicobasal polaritet20,21,22. Dessutom tillåter det tredimensionella (3D) kultursystemet generering av dorsala förhjärnorganoider som rekapitulerar många funktioner i människans cerebrala när utveckling23,24,25,26. Dessa två kompletterande cellbaserade modelleringsmetoder erbjuder spännande perspektiv för att dissekera engagemanget av PC under normal och patologisk utveckling av hjärnbarken.
Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för generering och karakterisering av neurala rosetter och härledda NSPCs samt dorsala forebrain organoider. Vi tillhandahåller också detaljerade protokoll för att analysera biogenes och funktion av PC som finns på NSPCs genom att testa transduktionen av Sonic Hedgehog utbildningsavsnittet och analysera dynamiken hos viktiga molekyler som är involverade i denna väg. För att dra nytta av 3D-organisationen av cerebrala organoider, inrättade vi också en enkel och kostnadseffektiv metod för 3D-avbildning av in toto immunstained cerebrala organoider som möjliggör snabbt förvärv, tack vare ett ljusplåtmikroskop, av hela organoiden, med hög upplösning som gör det möjligt att visualisera PC på alla typer av neokortikala stamceller och neuroner i hela organoiden. Slutligen anpassade vi immunohistochemistry på 150 μm fritt flytande sektioner med efterföljande clearing och förvärv med hjälp av resonans skanning konfokal mikroskop möjliggör högupplöst bild förvärv, vilket krävs för detaljerad analys av PC biogenes och funktion. Specifikt tillåter 3D-imaging programvara 3D-rekonstruktion av PC med efterföljande analys av morfologiska parametrar inklusive längd, antal och orientering av PC samt signalintensitet mätning av ciliary komponenter längs axoneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
PC betraktas nu som viktiga organeller som reglerar avgörande steg under normal cerebral när utveckling18,19,31 inklusive NSPC-expansion och åtagande8,9,10,11,12 samt neuronal migration13,14 och synaptogen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från Agence Nationale de la Recherche (ANR) till S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) och N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 och ANR-19-CE16-0002-01). LB stöds av ANR under Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01) och Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-program). Imagine Institute stöds av statlig finansiering från ANR inom ramen för Investissements d’avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-projekt) och som en del av det andra Investissements d’Avenir-programmet (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
