JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

بناء نموذج الأغشية الدهنية دمج G-البروتين إلى جانب المستقبلات (GPCRs)

Published: February 05, 2022
doi:
10.3791/62830
, ,
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,University of Southern California

Summary

يستخدم هذا البروتوكول تورم الآجاروز كتقنية قوية وقابلة للتعميم لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) في الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة (GUVs) ، كما هو موضح هنا لإعادة تشكيل بروتين مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) ، وهي واحدة من فئات مستقبلات G ذات الأهمية الدوائية المقترنة بالبروتين.

Abstract

كانت التحقيقات القوية في المختبر لهيكل ووظيفة بروتينات الغشاء المتكاملة تحديا بسبب تعقيدات غشاء البلازما والعوامل العديدة التي تؤثر على سلوك البروتين في الخلايا الحية. الحويصلات العملاقة unilamellar (GUVs) هي نظام نموذج محاكاة حيوية وغير قادر للغاية في المختبر للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والغشاء والتحقيق في سلوك البروتين بطريقة دقيقة تعتمد على التحفيز. في هذا البروتوكول, نقدم طريقة غير مكلفة وفعالة لتصنيع GUVs مع مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) متكاملة بشكل ثابت في الغشاء. نحن تصنيع GUVs باستخدام طريقة تورم الهيدروجيل المعدلة; عن طريق إيداع فيلم الدهون على رأس خليط من الآغاروز و 5-HT1AR ومن ثم ترطيب النظام بأكمله، يمكن تشكيل الحويصلات مع موجهة بشكل صحيح والوظيفية 5-HT1AR دمجها في الغشاء. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه GUVs لفحص التفاعلات بين البروتين والأغشية وسلوك التعريب عن طريق المجهر. في نهاية المطاف ، يمكن لهذا البروتوكول تعزيز فهمنا لوظيفة بروتينات الأغشية المتكاملة ، مما يوفر رؤية فسيولوجية عميقة.

Introduction

الأغشية الاصطناعية النموذجية هي أدوات قوية في التحقيق في الخصائص والوظائف الأساسية للأغشية الحيوية. الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) هي واحدة من أبرز المنصات لدراسة مجموعة متنوعة من خصائص غشاء البلازما ويمكن هندستها لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة1،2،3،4،5،6،7،8. ومن الثابت أن غشاء البلازما وتنظيمه يلعبان دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية، مثل نقل الإشارات، والالتصاق، وداء الغدد الصماء، والنقل9،10،11،12،13،14،15.

وقد تم تصنيع GUVs باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الترطيب لطيف16، تورم الهيدروجيل17، التشكيل الكهربائي18، تقنيات microfluidic19،20،21،22، jetting23، وتبادل المذيبات24،25،26. بسبب التحديات في التعامل مع بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) ، كانت منصات المختبر لمدرستها محدودة. تقدم GUVs منصة مبسطة لدراسة IMPs في بيئة تحاكي بيئتها الأصلية. على الرغم من وجود العديد من النهج لإعادة تشكيل البروتين في GUVs ، تنشأ تحديات من دمج البروتينات مع التوجه الصحيح والحفاظ على وظائف البروتين27.

تتطلب إعادة تشكيل البروتين الأكثر نجاحا في GUVs طريقة تبادل المنظفات؛ الذي ينطوي على solubilizing البروتينات من بيئتها الأصلية من المنظفات، تليها تنقية البروتين، ومن ثم استبدال جزيئات المنظفات مع الدهون من خلال أساليب مختلفة28. في حين أن المنظفات تعمل على تثبيت الهيكل الثالث ل IMPs أثناء التطهير ، فإن ميقات المنظفات هي بيئة غير طبيعية نسبيا لهذه البروتينات ، والتي يتم تثبيتها بشكل أفضل ، خاصة للدراسات الوظيفية ، في ثنائيات الطبقات الدهنية28،29،30. وعلاوة على ذلك، كان من الصعب دمج بروتينات ترانسممبران الوظيفية في طبقة الدهون باستخدام تقنيات تصنيع GUV التقليدية بسبب الحجم، وحساسية هذه البروتينات، وخطوات تبادل المنظفات الإضافية التي ستكون مطلوبة27،31،32،33. استخدام المذيبات العضوية لإزالة المنظفات يسبب تجميع البروتين وإزالة التورينج34. وقد تم تحسين طريقة بوساطة المنظفات واعدة، ومع ذلك، هناك حاجة إلى الحذر لخطوة إزالة المنظفات والتحسين قد تكون هناك حاجة لبروتينات محددة31،35. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحد الطرق التي تستخدم التشكيل الكهربائي من اختيار البروتين وقد لا تكون مناسبة لجميع التراكيب الدهنية وخاصة الدهون المشحونة31,36,37. تقنية أخرى تم استخدامها هي الانصهار الناجم عن الببتيد من الحويصلات الكبيرة unilamellar (LUVs) التي تحتوي على البروتين المطلوب مع GUVs ، على الرغم من أنه وجد أن تكون شاقة ويمكن أن تؤدي إلى إدراج جزيئات غريبة – الببتيدات fusogenic333،38،39. يمكن استخدام الحويصلات العملاقة لغشاء البلازما (GPMVs) ، المشتقة من الخلايا الحية ، للتغلب على بعض هذه القضايا ، ومع ذلك فهي تسمح بالحد الأدنى من التحكم في تكوين الدهون والبروتين الناتج14،40،41. لذلك ، فإن دمج IMPs في طبقة ثنائية الدهون من GUVs باستخدام طريقة تورم الآغروز المعدلة لدينا يقدم طريقة موثوقة لمواصلة فحص هذه البروتينات في بيئة الغشاء42،43،44،45.

الإشارات الخلوية والاتصالات ينطوي على عائلة من البروتينات المعروفة باسم مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs); GPCRs هي من بين أكبر عائلة من البروتينات وترتبط مع تعديل المزاج والشهية وضغط الدم ووظيفة القلب والأوعية الدموية والتنفس والنوم بين العديد من الوظائف الفسيولوجية الأخرى46. في هذه الدراسة, استخدمنا مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) وهو عضو نموذجي في الأسرة GPCR. 5-HT1AR يمكن العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والأوعية الدموية. فإنه يؤثر على العديد من الوظائف مثل القلب والأوعية الدموية، الجهاز الهضمي، وظائف الغدد الصماء، فضلا عن المشاركة في تنظيم mood47. ينشأ حاجز كبير أمام أبحاث GPCR من بنيتها البرمائية المعقدة ، وتوفر GUVs منصة واعدة للتحقيق في الخصائص المختلفة ذات الاهتمام ، بدءا من وظائف البروتين ، والتفاعلات بين البروتين الدهني والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين. وقد استخدمت نهج مختلفة لدراسة التفاعلات بين البروتين الدهني مثل الرنين السطحي البلازمون (SPR)48,49، التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)50,51، تراكب الدهون البروتينية (PLO) المقايسة51,52,53,54، قياس الطيف الكتلي الأصلي55، قياس حراري المعايرة الحرارية (ITC)56,57، والليبوسوم الترسيب المقايسة58,59. وقد استخدم مختبرنا نهج GUV المبسط للتحقيق في تأثير التفاعلات بين البروتين الدهني على وظائف البروتين عن طريق تحفيز BODIPY-GTPοS ، الذي يرتبط مع وحدة Giα الفرعية في الحالة النشطة للمستقبلات. ويفك ربطها الفلوروفور الذي ينتج إشارة مضانة يمكن اكتشافها بمرور الوقت45. وعلاوة على ذلك، حققت دراسات مختلفة في التفاعلات بين البروتين الدهني ودور البروتينات في استشعار أو تثبيت انحناء الأغشية60,61، ويمكن أن يكون استخدام نهج GUV الممكن ميزة رئيسية.

يوضح هذا البروتوكول طريقة مباشرة لدمج GPCRs في غشاء GUVs باستخدام نظام agarose هيدروجيل معدل17,42. وعلاوة على ذلك، واستنادا إلى عملنا السابق، يمكن أن تكون طريقتنا مناسبة لIMPs التي يمكن أن تحمل التعرض على المدى القصير إلى 30-40 درجة مئوية. باختصار، ونحن نشر فيلم رقيقة من الآغاروز جنبا إلى جنب مع شظايا الغشاء التي تحتوي على GPCR من الفائدة. بعد هلام هذه الطبقة، ونحن إيداع محلول الدهون فوق agarose والسماح للمذيب لتتبخر. ثم تم تنفيذ الإماهة للنظام مع عازل مائي، مما أدى إلى تشكيل GUVs مع البروتين المدرجة في طبقة ثنائية الدهون.

Protocol

1. وضع العلامات البروتين السماح NHS-رودامين، 5-HT1A شظايا الغشاء، واحد 7 K MWCO تدور عمود تحلية إلى التوازن في درجة حرارة الغرفة. حل 1 ملغ من NHS-رودامين في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO). إضافة 5 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم 1 M لزيادة درجة الحموضة من محلول 5-HT…

Representative Results

تم قياس تركيز البروتين، وتم حساب درجة وضع العلامات كنسبة الضرس بين الصبغة والبروتين لتكون 1:1. من خلال فحص GUVs باستخدام المجهر الكونف البؤري ، تمكنا من تأكيد نجاح تكوين وتكامل البروتين من الحويصلات. وصفت الدهون مع 0.4 مول٪ ATTO 488-DPPE، ووصفت البروتين بشكل مشترك عن طريق تعديل رودامين NHS-ester من الأمي…

Discussion

لقد حددنا خطوتين حاسمتين لنجاح البروتوكول العام: علاج البلازما وترسب الدهون. تنظيف البلازما ينجز شيئين: أولا، فإنه يزيل آثار المواد العضوية من سطح الزجاج. ثانيا، فإنه ينشط سطح الغطاء، مما يسمح لزيادة في wettability كما يزيد hydrophilicity سطح الزجاج62،63. لمس سطح coverlip تن?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر ماثيو بلوسر على النقاش والمشورة القيمة. وقد دعم هذا العمل مكتب البحوث البحرية (N00014-16-1-2382) والمؤسسة الوطنية للعلوم (PHY-1915017).

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum’s lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -. Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. , (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -. H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

GUVsGiant Unilamellar VesiclesMembrane ProteinsGPCRsG Protein-coupled Receptors5-HT1ARSerotonin ReceptorHydrogel ScaffoldLipid MembraneProtein IncorporationBiomimetic ModelIn Vitro Studies
check_url/62830?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image