Этот протокол использует набухание агарозы в качестве мощного и обобщаемого метода включения интегральных мембранных белков (ИМП) в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (ГУВ), как описано здесь для восстановления человеческого белка рецептора серотонина 1А (5-HT1AR), одного из классов фармакологически важных рецепторов, связанных с G-белком.
Надежные исследования in vitro структуры и функции интегральных мембранных белков были проблемой из-за сложности плазматической мембраны и многочисленных факторов, которые влияют на поведение белка в живых клетках. Гигантские одноламеллярные везикулы (ГУВ) представляют собой биомиметическую и высоко перестраиваемую модельную систему in vitro для исследования белково-мембранных взаимодействий и зондирования поведения белка точным, зависимым от стимула способом. В этом протоколе мы представляем недорогой и эффективный метод изготовления ГУВ с рецептором серотонина 1А человека (5-HT1AR), стабильно интегрированным в мембрану. Мы производим ГУВ с использованием модифицированного метода набухания гидрогеля; путем осаждения липидной пленки поверх смеси агарозы и 5-HT1AR, а затем гидратации всей системы, везикулы могут быть сформированы с правильно ориентированным и функциональным 5-HT1AR, включенным в мембрану. Эти ГУВ затем могут быть использованы для изучения белково-мембранных взаимодействий и поведения локализации с помощью микроскопии. В конечном счете, этот протокол может продвинуть наше понимание функциональности интегральных мембранных белков, обеспечивая глубокое физиологическое понимание.
Синтетические модельные мембраны являются мощным инструментом в исследовании фундаментальных свойств и функций биомембран. Гигантские одногламеллярные везикулы (ГУВ) являются одной из наиболее заметных платформ для изучения различных свойств плазматической мембраны и могут быть спроектированы для имитации различных физиологических условий1,2,3,4,5,6,7,8. Хорошо известно, что плазматическая мембрана и ее организация играют ключевую роль во множестве клеточных процессов, таких как сигнальная трансдукция, адгезия, эндоцитоз и транспорт9,10,11,12,13,14,15.
ГУВ были изготовлены с использованием различных методов, включая щадящую гидратацию16, набухание гидрогеля17, электроформацию18, микрофлюидные методы19,20,21,22, струйную обработку23 и обмен растворителями24,25,26. Из-за проблем в обращении с интегральными мембранными белками (IMP) платформы in vitro для их изучения были ограничены. GUV представляют собой упрощенную платформу для изучения IMP в среде, имитирующей их родную среду. Хотя существует несколько подходов к восстановлению белка в ГУВ, проблемы возникают из-за включения белков с правильной ориентацией и поддержания функциональности белка27.
Наиболее успешное восстановление белка в ГУВ требует метода обмена моющих средств; которая включает в себя солюбилизацию белков из их родной среды моющими средствами с последующей очисткой белка, а затем замену молекул моющего средства липидами с помощью различных методов28. В то время как моющие средства служат для стабилизации третичной структуры ИМП во время очистки, моющие мицеллы являются относительно неестественной средой для этих белков, которые лучше стабилизируются, особенно для функциональных исследований, в липидных бислоях28,29,30. Кроме того, включение функциональных трансмембранных белков в липидный бислой с использованием традиционных методов изготовления GUV было затруднено из-за размера, деликатности этих белков и дополнительных этапов обмена моющих средств, которые потребовались бы27,31,32,33. Использование органического растворителя для удаления моющих средств вызывает агрегацию и денатурацию белка34. Улучшенный метод, опосредованный моющим средством, был многообещающим, однако для этапа удаления моющего средства необходима осторожность, и оптимизация может потребоваться для конкретных белков31,35. Кроме того, способы, использующие электроформацию, могут ограничивать выбор белка и могут не подходить для всех липидных композиций, особенно заряженных липидов31,36,37. Другим методом, который был использован, является пептид-индуцированное слияние больших одноцветных везикул (LUV), содержащих желаемый белок, с ГУВ, хотя было обнаружено, что оно трудоемко и может привести к вставке чужеродных молекул – фузогенных пептидов33,38,39. Гигантские везикулы плазматической мембраны (GPMV), которые получены из живых клеток, могут быть использованы для преодоления некоторых из этих проблем, однако они позволяют минимально контролировать полученный липидный и белковый состав14,40,41. Таким образом, интеграция ИМП в билипидный слой ГУВ с использованием нашего модифицированного метода набухания агарозы представляет собой надежный метод дальнейшего изучения этих белков в мембранной среде42,43,44,45.
Клеточная сигнализация и связь включает в себя семейство белков, известных как рецепторы, связанные с G-белком (GPCR); GPCR являются одним из крупнейших семейств белков и связаны с модуляцией настроения, аппетита, артериального давления, сердечно-сосудистой функции, дыхания и сна среди многих других физиологических функций46. В этом исследовании мы использовали рецептор серотонина 1А человека (5-HT1AR), который является прототипом семейства GPCR. 5-HT1AR может быть обнаружен в центральной нервной системе (ЦНС) и кровеносных сосудах; он влияет на многочисленные функции, такие как сердечно-сосудистая, желудочно-кишечная, эндокринная функции, а также участвует в регуляции настроения47. Большой барьер для исследований GPCR возникает из-за их сложной амфифильной структуры, и ГУВ представляют собой многообещающую платформу для исследования различных интересующих свойств, начиная от функциональности белка, липидно-белковых взаимодействий и белково-белковых взаимодействий. Для изучения липидно-белковых взаимодействий были использованы различные подходы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR)48,49, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)50,51, анализ наложения липидов на белок (PLO) 51,52,53,54, нативная масс-спектрометрия55, изотермическая титрационная калориметрия (ITC)56,57 и липосома осадочный анализ58,59. Наша лаборатория использовала упрощенный подход GUV для исследования влияния липидно-белковых взаимодействий на функциональность белка путем инкапсуляции BODIPY-GTPγS, которая связывается с субъединицей Giα в активном состоянии рецептора. Их связывание разглаживает флуорофор, производя флуоресцентный сигнал, который может быть обнаружен с течением времени45. Кроме того, в различных исследованиях изучались липидно-белковые взаимодействия и роль белков в обнаружении или стабилизации кривизны мембраны60,61, и использование осуществимого подхода GUV может быть ключевым преимуществом.
Этот протокол демонстрирует простой метод включения GPCR в мембрану ГУВ с использованием модифицированной системы гидрогеля агарозы17,42. Кроме того, основываясь на нашей предыдущей работе, наш метод может быть подходящим для IMP, которые могут выдерживать кратковременное воздействие 30-40 ° C. Вкратце, мы распространили тонкую пленку агарозы в сочетании с фрагментами мембраны, содержащими интересующий GPCR. После гелеобразования этого слоя мы наносим раствор липидов поверх агарозы и позволяем растворителю испариться. Затем регидратацию системы выполняли с помощью водного буфера, в результате чего образовывались ГУВ с белком, включенным в липидный бислой.
Мы определили два шага, которые имеют решающее значение для успеха общего протокола: плазменная обработка и осаждение липидов. Плазменная очистка покровов имеет важное значение для обеспечения адекватного покрытия и адгезии гидрогеля агарозы к стеклянному покрову. Плазменная очистк?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Мэтью Блоссера за ценную дискуссию и советы. Эта работа была поддержана Управлением военно-морских исследований (N00014-16-1-2382) и Национальным научным фондом (PHY-1915017).
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
TI-Eclipse inverted microscope | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
5-HT1AR membrane fragments | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
Bench top plasma cleaner | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
chloroform (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
Cholesterol (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
Corning 96-well Flat Clear Bottom | Corning, Corning, NY | 3904 | |
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germany | [no longer sold on main website] | |
glucose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
methanol (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
spinning-disc CSUX confocal head | Yokogawa,Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
standard 25 mm no. 1 glass coverslips | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
sucrose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
Ultra-low melting temperature agarose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [no longer sold on main website] | |
VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |