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Bioengineering

G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)를 통합 한 모델 지질 막의 건설

Published: February 05, 2022
doi:
10.3791/62830
, ,
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,University of Southern California

Summary

이 프로토콜은 항리고적으로 중요한 G 단백질 결합 수용체의 종류 중 하나인 인간 1A 세로토닌 수용체 단백질(5-HT1AR)의 재구성을 위해 여기에 설명된 바와 같이, 일체형 막 단백질(IMP)을 거대한 유니라멜라 지질 소포(GUV)에 통합하기 위한 강력하고 일반화가능한 기술로 아가로즈 팽윤을 활용한다.

Abstract

일체막 단백질의 구조와 기능에 대한 견고한 체외 조사는 플라즈마 멤브레인의 복잡성과 살아있는 세포에서 단백질 거동에 영향을 미치는 수많은 요인으로 인해 어려움을 받고 있습니다. 거대한 unilamellar 소포 (GUV)는 단백질 막 상호 작용을 조사하고 정확하고 자극의존적인 방식으로 단백질 행동을 조사하기위한 생체 모방 및 고도의 튜닝 시험 관 모델 시스템입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 인간 세로토닌 1A 수용체 (5-HT1AR)로 GUV를 제조하기위한 저렴하고 효과적인 방법을 제시(5-HT1AR) 안정적으로 멤브레인에 통합. 변형된 하이드로겔 부종 방법을 사용하여 GUV를 제조합니다. 아가로즈와 5-HT1AR의 혼합물 위에 지질 필름을 증착한 다음 전체 시스템을 수분을 공급함으로써, 소포는 멤브레인에 통합된 적절히 지향적이고 기능적인 5-HT1AR으로 형성될 수 있다. 이 GUV는 그 때 현미경 검사를 통해 단백질 막 상호 작용 및 현지화 행동을 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다. 궁극적으로, 이 프로토콜은 일체형 막 단백질의 기능에 대한 이해를 발전시켜 심오한 생리적 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

합성 모형 멤브레인은 생물막의 근본적인 특성 및 기능에 대한 조사에서 강력한 도구입니다. 거대한 unilamellar 소포 (GUV)는 다양한 플라즈마 막 특성을 연구하는 가장 눈에 띄는 플랫폼 중 하나이며 다른 생리 적 조건을 모방하도록 설계 될 수있다1,2,3,4,5,6,7,8. 플라즈마 멤브레인과 그 조직이 신호 트랜스듀션, 접착, 내분비증 및 수송9,10,11,12,13,14,15와 같은 수많은 세포 공정에서 중요한 역할을 한다는 것이 잘 확립되어 있습니다.

GUV는 부드러운 수화16, 하이드로겔 부종17, 전기형성18, 미세유체 기술19,20,21,22, jetting23 및 용매 교환24,25,26을 포함한 다양한 방법을 사용하여 제조되었습니다. 일체막 단백질(ImP)을 처리하는 데 따르는 어려움으로 인해 이를 연구하는 시험관 내 플랫폼은 제한적이었습니다. GUV는 자신의 기본 환경을 모방하는 환경에서 IMP를 연구하기 위한 간소화된 플랫폼을 제공합니다. GUV에 있는 단백질 재구성을 위한 몇몇 접근이 있더라도, 도전은 올바른 방향에 단백질을 통합하고 단백질 기능을 유지에서 생겨나기 27.

GUV에서 가장 성공적인 단백질 재구성은 세제 교환 방법이 필요합니다. 세제에 의해 그들의 토착 환경에서 단백질을 용해시키고, 단백질 정제를 선행한 다음, 각종 방법을 통해 지질으로 세제 분자를 대체하는 관련시킵니다28. 세제는 정화 하는 동안 IMP의 삼차 구조를 안정화 하는 동안, 세제 미셀은 이러한 단백질에 대 한 상대적으로 부자연스러운 환경, 더 나은 안정화, 특히 기능 연구에 대 한, 지질 bilayers28,29,30. 더욱이, 기존의 GUV 제조 기술을 사용하여 지질 이중층에 기능성 막 단백질을 통합하는 것은 이러한 단백질의 크기, 진미, 그리고 필요한 추가 세제 교환 단계로 인해 어려웠다27,31,32,33. 세제를 제거하기 위해 유기 용매를 사용하면 단백질 응집 및 데니션34가 발생합니다. 개선된 세제 매개 방법은 유망하고 있지만, 세제 제거 단계에 주의가 필요하며 특정 단백질31,35에 최적화가 필요할 수 있습니다. 추가적으로, 전기형성을 활용하는 방법은 단백질의 선택을 제한할 수 있고 특히 충전된 지질31,36,37에 적합한 모든 지질 조성물에 적합하지 않을 수 있다. 사용 된 또 다른 기술은 GUV와 원하는 단백질을 포함하는 대형 unilamellar 소포 (LUV)의 펩타이드 유도 융합이지만, 힘들게 발견되었지만 이물질 펩타이드33,38,39의 삽입으로 이어질 수 있습니다. 살아있는 세포에서 파생되는 거대한 혈장 막 소포 (GPMV)는 이러한 문제 중 일부를 극복하는 데 사용할 수 있지만 결과 지질 및 단백질 조성물의 최소 제어를 허용14,40,41. 따라서, 변형된 아가로즈 팽창 방법을 이용한 GUV의 이중지질층에서 ImPs의 통합은 멤브레인 환경에서 이러한 단백질을 추가로 검사하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시한다42,43,44,45.

세포 신호 및 통신은 G 단백질 결합 수용체로 알려진 단백질의 가족을 포함 (GPCRs); GPCR은 단백질의 가장 큰 가족 중 하나이며 기분 조절과 관련이 있습니다, 식욕, 혈압, 심장 혈관 기능, 호흡, 및 다른 많은 생리 적 기능 중 수면46. 이 연구에서는, 우리는 GPCR 가족의 프로토 타입 구성원인 인간 세로토닌 1A 수용체 (5-HT1AR)를 사용했습니다. 5-HT1AR은 중추 신경계 (CNS) 및 혈관에서 찾을 수 있습니다; 그것은 심장 혈관 등 수많은 기능에 영향을, 위장, 내 분 비 기능, 뿐만 아니라 mood47의 규칙에 참여. GPCR 연구에 큰 장벽은 복잡한 양용 성 구조에서 발생하며, GUV는 단백질 기능성, 지질 단백질 상호 작용 및 단백질 단백질 상호 작용에 이르기까지 다양한 관심 특성을 조사할 수있는 유망한 플랫폼을 제시합니다. 표면 플라스몬 공명(SPR)48,49, 핵자기 공명 분광 법(NMR)50,51, 단백질 지질 오버레이(PLO) 분석 51,52,53,54, 토착 질량 분광법 5,555, 모종 질량 분광법 5C와 같은 지질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 다양한 접근법이 활용되었습니다. 퇴적 분석 58,59. 우리의 실험실은 수용체의 활성 상태에서 Giα 서브유닛과 결합하는 BODIPY-GTPγS를 캡슐화하여 단백질 기능에 지질 단백질 상호 작용의 효력을 조사하기 위하여 단순화된 GUV 접근을 이용했습니다. 그들의 결합은 시간이 지남에 따라 검출될 수 있는 형광 신호를 생성하는 형광신호를 풀어 내지 않습니다45. 더욱이, 다양한 연구는 지질 단백질 상호 작용과 감지 또는 안정화 막 곡률60,61에서 단백질의 역할을 조사하고, 가능한 GUV 접근을 활용하는 것이 주요 이점이 될 수 있습니다.

이 프로토콜은 변형된 아가로즈 하이드로겔 시스템17,42를 사용하여 GPCRs를 GUV의 멤브레인에 통합하는 간단한 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리의 이전 작업에 따라, 우리의 방법은 30-40 ° C에 단기 노출을 견딜 수있는 IMP에 적합 할 수있다. 간단히, 우리는 관심의 GPCR을 포함하는 막 파편과 결합 된 아가로즈의 박막을 확산. 이 층의 겔화에 따라, 우리는 아가로즈 위에 지질 용액을 착유하고 용매가 증발 할 수 있습니다. 시스템의 재수화는 수성 완충제로 수행되었고, 그 결과 지질 이중층에 단백질이 통합된 GUV의 형성을 초래하였다.

Protocol

1. 단백질 라벨링 NHS-로다민, 5-HT1A 멤브레인 파편, 그리고 17 K MWCO 스핀 탈염 컬럼을 실내 온도에서 평형화 할 수 있습니다. 디메틸 설산화물(DMSO)의 100 μL에서 NHS 로다민 1 mg을 녹입니다. 5μL의 1M 나트륨 중탄산염 용액을 추가하여 5-HT1AR 용액의 pH를 pH 8로 증가시면 됩니다. NHS-로다민 용액의 3.66 μL을 5-HT1AR 용액의 50 μL에 추가하고 마이크로 센티…

Representative Results

단백질의 농도를 측정하였고, 라벨링 정도는 염료와 단백질 사이의 어금니 비로 1:1로 계산되었다. 공초점 현미경 검사를 사용하여 GUV를 검사함으로써 소포의 성공적인 형성 및 단백질 통합을 확인할 수 있었습니다. 지질은 0.4 mol% ATTO 488-DPPE로 표지되었고, 단백질은 1차 아민의 로다민 NHS-에스테르 변형을 통해 공유로 표지되었다. 도 2a 및 도 2b 는 각각 …

Discussion

플라즈마 처리와 지질 증착이라는 전체 프로토콜의 성공에 중요한 두 가지 단계를 확인했습니다. 플라즈마 청소는 두 가지를 달성 : 첫째, 유리 표면에서 유기 물질의 흔적을 제거; 둘째, 커버슬립 표면을 활성화하여 유리 표면 친수성이 증가함에 따라 웨이트성이 증가하여 62,63. 커버슬립 표면 후 플라즈마 세척을 만지면 초클린 표면이 비활성화되고 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 귀중한 토론과 조언을 매튜 블로셔에게 감사드립니다. 이 작품은 해군 연구실 (N00014-16-16-1-2382)과 국립 과학 재단 (PHY-1915017)에 의해 지원되었다.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882
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Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).
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