Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

Summary

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell’agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (_5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Abstract

Robuste indagini in vitro sulla struttura e la funzione delle proteine di membrana integrali sono state una sfida a causa delle complessità della membrana plasmatica e dei numerosi fattori che influenzano il comportamento delle proteine nelle cellule vive. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono un sistema modello in vitro biomimetico e altamente sintonizzabile per studiare le interazioni proteina-membrana e sondare il comportamento proteico in modo preciso e dipendente dallo stimolo. In questo protocollo, presentiamo un metodo economico ed efficace per fabbricare GUV con il recettore umano della serotonina 1A (_5-HT1AR) stabilmente integrato nella membrana. Fabbrichiamo GUV utilizzando un metodo di rigonfiamento dell’idrogel modificato; depositando un film lipidico sopra una miscela di agarosio e _5-HT1AR e quindi idratando l’intero sistema, si possono formare vescicole con _{5-HT1AR opportunamente} orientato e funzionale incorporato nella membrana. Questi GUV possono quindi essere utilizzati per esaminare le interazioni proteina-membrana e il comportamento di localizzazione tramite microscopia. In definitiva, questo protocollo può far progredire la nostra comprensione della funzionalità delle proteine di membrana integrali, fornendo una profonda comprensione fisiologica.

Introduction

Le membrane modello sintetiche sono potenti strumenti nello studio delle proprietà e delle funzioni fondamentali delle biomembrane. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono una delle piattaforme più importanti per studiare una varietà di proprietà della membrana plasmatica e possono essere progettate per imitare diverse condizioni fisiologiche1,2,3,4,5,6,7,8. È ben noto che la membrana plasmatica e la sua organizzazione svolgono un ruolo chiave in una moltitudine di processi cellulari, come la trasduzione del segnale, l’adesione, l’endocitosi e il trasporto9,10,11,12,13,14,15.

I GUV sono stati fabbricati utilizzando vari metodi, tra cui idratazione ^delicata16, gonfiore dell’idrogel17, elettroformazione18, tecniche microfluidiche19,20,21,22, ^jetting23 e scambio di solventi24,25,26. A causa delle difficoltà nella gestione delle proteine integrali di membrana (PIM), le piattaforme in vitro per studiarle sono state limitate. I GUV presentano una piattaforma semplificata per lo studio degli IMP in un ambiente che imita il loro ambiente nativo. Sebbene ci siano stati diversi approcci per la ricostituzione proteica nei GUV, le sfide derivano dall’incorporazione di proteine con il corretto orientamento e dal mantenimento della funzionalità ^proteica27.

La ricostituzione proteica di maggior successo nei GUV richiede il metodo di scambio del detergente; che comporta la solubilizzazione delle proteine dal loro ambiente nativo mediante detergenti, seguita dalla purificazione delle proteine, e quindi la sostituzione delle molecole detergenti con lipidi attraverso vari ^metodi28. Mentre i detergenti servono a stabilizzare la struttura terziaria degli PIM durante la purificazione, le micelle detergenti sono un ambiente relativamente innaturale per queste proteine, che sono meglio stabilizzate, in particolare per gli studi funzionali, in doppiostrati lipidici28,29,30. Inoltre, incorporare proteine transmembrana funzionali nel doppio strato lipidico utilizzando le tradizionali tecniche di fabbricazione GUV è stato difficile a causa delle dimensioni, della delicatezza di queste proteine e delle fasi aggiuntive di scambio di detergenti che sarebbero necessarie27,31,32,33. L’uso di solventi organici per rimuovere i detergenti provoca aggregazione proteica e ^{denaturazione34}. Un metodo migliorato mediato dal detergente è stato promettente, tuttavia, è necessaria cautela per la fase di rimozione del detergente e potrebbe essere necessaria un’ottimizzazione per proteine ^{specifiche31,35}. Inoltre, i metodi che utilizzano l’elettroformazione potrebbero limitare la scelta delle proteine e potrebbero non essere adatti a tutte le composizioni lipidiche, in particolare i lipidi caricati31,36,37. Un’altra tecnica che è stata utilizzata è la fusione indotta da peptidi di grandi vescicole unilamellari (LUV) contenenti la proteina desiderata con GUV, sebbene sia risultata laboriosa e possa portare all’inserimento di molecole estranee- i peptidi fusogenici33,38,39. Le vescicole giganti della membrana plasmatica (GPMV), che derivano da cellule viventi, possono essere utilizzate per superare alcuni di questi problemi, tuttavia consentono un controllo minimo della composizione lipidica e proteica risultante14,40,41. Pertanto, l’integrazione di PIM nello strato bilipidico dei GUV utilizzando il nostro metodo di gonfiore dell’agarosio modificato presenta un metodo affidabile per esaminare ulteriormente queste proteine nell’ambiente di membrana42,43,44,45.

La segnalazione e la comunicazione cellulare coinvolgono una famiglia di proteine note come recettori accoppiati alla proteina G (GPCR); I GPCR fanno parte della più grande famiglia di proteine e sono associati alla modulazione dell’umore, dell’appetito, della pressione sanguigna, della funzione cardiovascolare, della respirazione e del sonno tra molte altre funzioni ^{fisiologiche46}. In questo studio, abbiamo utilizzato il recettore umano della serotonina 1A (_5-HT1AR) che è un membro prototipico della famiglia GPCR. _5-HT1AR può essere trovato nel sistema nervoso centrale (SNC) e nei vasi sanguigni; influenza numerose funzioni come le funzioni cardiovascolari, gastrointestinali, endocrine, oltre a partecipare alla regolazione ^{dell’umore47}. Una grande barriera alla ricerca GPCR deriva dalla loro complessa struttura anfifila e i GUV presentano una piattaforma promettente per lo studio di varie proprietà di interesse, che vanno dalla funzionalità proteica, alle interazioni lipidico-proteina e alle interazioni proteina-proteina. Vari approcci sono stati utilizzati per studiare le interazioni lipidico-proteina come la risonanza plasmonica di superficie (SPR)^48,49, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)^50,51, il saggio di sovrapposizione lipidica proteica (PLO)^51,52,53,54, la spettrometria di massa ^nativa55, la calorimetria di titolazione isotermica (ITC)^56,57 e il liposoma saggio di ^{sedimentazione58,59}. Il nostro laboratorio ha utilizzato l’approccio GUV semplificato per studiare l’effetto delle interazioni lipidico-proteina sulla funzionalità proteica incapsulando BODIPY-GTPγS, che si lega con la subunità _Giα nello stato attivo del recettore. Il loro legame incanta il fluoroforo producendo un segnale di fluorescenza che potrebbe essere rilevato nel ^tempo45. Inoltre, vari studi hanno studiato le interazioni lipidico-proteina e il ruolo delle proteine nel rilevare o stabilizzare la curvatura della ^{membrana60,61}, e l’utilizzo di un approccio GUV fattibile potrebbe essere un vantaggio chiave.

Questo protocollo dimostra un metodo semplice per incorporare i GPCR nella membrana dei GUV utilizzando un sistema di idrogel di agarosio ^{modificato17,42}. Inoltre, sulla base del nostro lavoro precedente, il nostro metodo potrebbe essere adatto per i PIM che possono sopportare un’esposizione a breve termine a 30-40 °C. In breve, abbiamo diffuso un sottile film di agarosio combinato con frammenti di membrana contenenti il GPCR di interesse. Dopo la gelificazione di questo strato, depositiamo una soluzione lipidica sopra l’agarosio e lasciamo evaporare il solvente. La reidratazione del sistema è stata quindi eseguita con un tampone acquoso, con conseguente formazione di GUV con proteine incorporate nel doppio strato lipidico.

Protocol

1. Etichettatura delle proteine Consentire a NHS-Rhodamine, ai frammenti di membrana 5-HT1A e a una colonna di dissalazione di spin 7 K MWCO di equilibrarsi a temperatura ambiente. Sciogliere 1 mg di NHS-rodamina in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO). Aggiungere 5 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 1 M per aumentare il pH della soluzione 5-HT1AR a pH 8. Aggiungere 3,66 μL della soluzione NHS-rodamina a 50 μL della soluzione 5-HT1AR e pipett…

Representative Results

La concentrazione di proteine è stata misurata e il grado di etichettatura è stato calcolato come il rapporto molare tra il colorante e la proteina per essere 1: 1. Esaminando i GUV utilizzando la microscopia confocale, siamo stati in grado di confermare la formazione e l’integrazione proteica delle vescicole. I lipidi sono stati etichettati con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE e la proteina è stata etichettata covalentemente tramite la modifica dell’estere NHS della rodamina delle ammine primarie. La Figur…

Discussion

Abbiamo identificato due passaggi fondamentali per il successo del protocollo complessivo: il trattamento al plasma e la deposizione lipidica. La pulizia al plasma dei coverslip è essenziale per garantire che vi sia un’adeguata copertura e adesione dell’idrogel di agarosio al coperchio di vetro. La pulizia al plasma realizza due cose: in primo luogo, rimuove tracce di materia organica dalla superficie del vetro; in secondo luogo, attiva la superficie del coverslip, consentendo un aumento della bagnabilità all’aumentare…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882