Konstruksjon av modell lipidmembraner som inkorporerer G-proteinkoblede reseptorer (GPCRs)

Summary

Denne protokollen benytter agarose hevelse som en kraftig og generaliserbar teknikk for å inkorporere integrerte membranproteiner (IMPs) i gigantiske unilamellar lipid vesicles (GUVs), som beskrevet her for rekonstituering av humant 1A serotoninreseptorprotein (_5-HT1AR), en av klassene av farmakologisk viktige G protein-koblede reseptorer.

Abstract

Robuste in vitro-undersøkelser av strukturen og funksjonen til integrerte membranproteiner har vært en utfordring på grunn av kompleksiteten i plasmamembranen og de mange faktorene som påvirker proteinadferd i levende celler. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er et biomimetisk og svært justerbart in vitro-modellsystem for å undersøke proteinmembraninteraksjoner og undersøke proteinadferd på en presis, stimulusavhengig måte. I denne protokollen presenterer vi en billig og effektiv metode for å fremstille GUVer med den menneskelige serotonin 1A-reseptoren (_5-HT1AR) stabilt integrert i membranen. Vi fremstiller GUVs ved hjelp av en modifisert hydrogel hevelse metode; ved å deponere en lipidfilm på toppen av en blanding av agarose og _5-HT1AR og deretter hydrere hele systemet, kan vesikler dannes med riktig orientert og funksjonell 5-HT1AR innlemmet i membranen. Disse GUVene kan deretter brukes til å undersøke proteinmembraninteraksjoner og lokaliseringsatferd via mikroskopi. Til syvende og sist kan denne protokollen fremme vår forståelse av funksjonaliteten til integrerte membranproteiner, noe som gir dyp fysiologisk innsikt.

Introduction

Syntetiske modellmembraner er kraftige verktøy i undersøkelsen av biomembranes grunnleggende egenskaper og funksjoner. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er en av de mest fremtredende plattformene for å studere en rekke plasmamembranegenskaper og kan konstrueres for å etterligne forskjellige fysiologiske forhold1,2,3,4,5,6,7,8. Det er godt fastslått at plasmamembranen og dens organisasjon spiller en nøkkelrolle i en rekke cellulære prosesser, for eksempel signaltransduksjon, vedheft, endokytose og transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVer har blitt fremstilt ved hjelp av ulike metoder, inkludert skånsom ^hydrering16, hydrogel ^hevelse17, elektroformasjon18, mikrofluidiske teknikker19,20,21,22, ^jetting23 og løsningsmiddelutveksling24,25,26. På grunn av utfordringer med å håndtere integrerte membranproteiner (IMPer), har in vitro-plattformer for å studere dem vært begrenset. GUVer presenterer en forenklet plattform for å studere IMPer i et miljø som etterligner deres opprinnelige miljø. Selv om det har vært flere tilnærminger for proteinrekonstituering i GUVer, oppstår utfordringer ved å inkorporere proteiner med riktig orientering og opprettholde ^{proteinfunksjonalitet27}.

Mest vellykket proteinrekonstituering i GUVer krever vaskemiddelutvekslingsmetoden; som innebærer å løse proteinene fra sitt opprinnelige miljø av vaskemidler, etterfulgt av proteinrensing, og deretter erstatte vaskemiddelmolekylene med lipider gjennom ulike ^metoder28. Mens vaskemidler tjener til å stabilisere den tertiære strukturen til IMPer under rensing, er vaskemiddel micelles et relativt unaturlig miljø for disse proteinene, som er bedre stabilisert, spesielt for funksjonelle studier, i lipid bilayers28,29,30. Videre har det vært vanskelig å innlemme funksjonelle transmembranproteiner i lipidbilayeren ved hjelp av tradisjonelle GUV-fabrikasjonsteknikker på grunn av størrelsen, delikatessen til disse proteinene og de ekstra rengjøringsmiddelutvekslingstrinnene som trengs27,31,32,33. Bruk av organisk løsningsmiddel for å fjerne vaskemidler forårsaker proteinaggregering og ^denaturing34. En forbedret vaskemiddelmediert metode har vært lovende, men forsiktighet er nødvendig for rengjøringsmiddel fjerning trinn og optimalisering kan være nødvendig for spesifikke ^{proteiner31,35}. I tillegg kan metoder som bruker elektroformasjon begrense valg av protein og er kanskje ikke egnet for alle lipidsammensetninger spesielt ladede lipider31,36,37. En annen teknikk som har blitt brukt er peptidindusert fusjon av store unilamellar vesikler (LUVer) som inneholder ønsket protein med GUVs, selv om det ble funnet å være arbeidskrevende og kan føre til innsetting av fremmede molekyler – de fusogene peptidene33,38,39. Giant plasmamembran vesicles (GPMVs), som er avledet fra levende celler, kan brukes til å overvinne noen av disse problemene, men de tillater minimal kontroll av den resulterende lipid- og proteinsammensetningen14,40,41. Derfor presenterer integrasjonen av IMPer i bilipidlaget av GUVer ved hjelp av vår modifiserte agarose hevelsesmetode en pålitelig metode for å undersøke disse proteinene i membranmiljøet ytterligere42,43,44,45.

Cellulær signalering og kommunikasjon innebærer en familie av proteiner kjent som G protein-koblede reseptorer (GPCRs); GPCRs er blant de største familien av proteiner og er forbundet med modulerende humør, appetitt, blodtrykk, kardiovaskulær funksjon, åndedrett og søvn blant mange andre fysiologiske ^funksjoner46. I denne studien brukte vi human serotonin 1A reseptor (_5-HT1AR) som er et prototypisk medlem av GPCR-familien. _5-HT1AR finnes i sentralnervesystemet (CNS) og blodårene; det påvirker mange funksjoner som kardiovaskulære, gastrointestinale, endokrine funksjoner, samt deltakelse i regulering av ^humør47. En stor barriere mot GPCR-forskning oppstår fra deres komplekse amfifile struktur, og GUVer presenterer en lovende plattform for undersøkelse av ulike egenskaper av interesse, alt fra proteinfunksjonalitet, lipidproteininteraksjoner og proteinproteininteraksjoner. Ulike tilnærminger har blitt brukt til å studere lipidproteininteraksjoner som overflateplasmonresonans (SPR)^48,49, kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR)^50,51, protein lipidoverlegg (PLO) assay51,52,53,54, innfødt massespektrometri55, isotermisk titreringskalorimetri (ITC)^56,57 og liposom sedimenteringsanalyse58,59. Laboratoriet vårt har brukt den forenklede GUV-tilnærmingen for å undersøke effekten av lipidproteininteraksjoner på proteinfunksjonalitet ved å inkapsulere BODIPY-GTPγS, som binder seg til _{Giα-underenheten} i reseptorens aktive tilstand. Deres binding løsner fluoroforen som produserer et fluorescenssignal som kan oppdages over ^tid45. Videre undersøkte ulike studier Lipid-proteininteraksjoner og proteinenes rolle i å registrere eller stabilisere membrankurvatur60,61, og bruk av en mulig GUV-tilnærming kan være en viktig fordel.

Denne protokollen demonstrerer en enkel metode for å inkorporere GPCRs i membranen til GUVer ved hjelp av et modifisert agarose ^{hydrogelsystem17,42}. Videre, basert på vårt tidligere arbeid, kan vår metode være egnet for IMPer som kan bære kortsiktig eksponering for 30-40 °C. Kort sagt sprer vi en tynn film av agarose kombinert med membranfragmenter som inneholder GPCR av interesse. Etter gelering av dette laget legger vi en lipidløsning på toppen av agarose og lar løsningsmidlet fordampe. Rehydrering av systemet ble deretter utført med en vandig buffer, noe som resulterte i dannelse av GUVer med protein innlemmet i lipidbilayeren.

Protocol

1. Proteinmerking Tillat NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragmenter og en 7 K MWCO spin desalting kolonne å likevektere ved romtemperatur. Løs opp 1 mg NHS-rhodamin i 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO). Tilsett 5 μL 1 M natriumbikarbonatoppløsning for å øke pH-en til 5-HT1AR-oppløsningen til pH 8. Tilsett 3,66 μL av NHS-rhodaminoppløsningen til 50 μL av 5-HT1AR-oppløsningen og pipetten forsiktig opp og ned i et mikrosenterrør.MERK: Sørg f…

Representative Results

Konsentrasjonen av protein ble målt, og graden av merking ble beregnet som molarforholdet mellom fargestoffet og proteinet til å være 1: 1. Ved å undersøke GUVene ved hjelp av konfektmikroskopi, kunne vi bekrefte vellykket dannelse og proteinintegrasjon av vesiklene. Lipidene ble merket med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, og proteinet ble kovalent merket via rhodamin NHS-ester modifikasjon av primære aminer. Figur 2a og figur 2b viser en proteininkorporert vesicle…

Discussion

Vi har identifisert to trinn som er avgjørende for suksessen til den overordnede protokollen: plasmabehandling og lipidavsetning. Plasmarengjøring av dekslene er avgjørende for å sikre at det er tilstrekkelig dekning og vedheft av agarose hydrogel til glasslipdekslene. Plasmarengjøring oppnår to ting: for det første fjerner det spor av organisk materiale fra glassoverflaten; For det andre aktiverer den dekslene, noe som gir en økning i fuktbarheten etter hvert som glassoverflatens hydrofilisitet <sup class="xref"…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882