Fluorescensaktiveret cellesortering-radioligandbehandlet væv (FACS-RTT) er et kraftfuldt værktøj til at studere rollen som 18 kDa translocatorprotein eller Serotonin 5HT 2A-receptorekspression i Alzheimers sygdom i cellulær skala. Denne protokol beskriver ex vivo-anvendelsen af FACS-RTT i TgF344-AD-rottemodellen.
Gliaceller har sandsynligvis en betydelig implikation i patofysiologien af neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom (AD). Deres ændringer er måske forbundet med en proinflammatorisk tilstand. TgF344-AD rottestammen er designet til at udtrykke humane APP- og humane PS1ΔE9-gener , der koder for amyloidproteiner Aβ-40 og Aβ-42 og viser amyloidpatologi og kognitive underskud med aldring. TgF344-AD rottemodellen anvendes i denne undersøgelse til at evaluere den cellulære oprindelse af 18 kDa translocatorproteinet (TSPO, en markør for gliacelleaktivering) binding og 5HT2A-receptoren (5HT2AR) serotoninreceptorniveauer, der muligvis forstyrres i AD. Den teknik, der præsenteres her, er fluorescensaktiveret cellesortering til radioligandbehandlet væv (FACS-RTT), en kvantitativ celletypespecifik teknik, der supplerer in vivo PET- eller SPECT- eller ex vivo/in vitro-autoradiografiteknikker . Det kvantificerer det samme radioaktivt mærkede sporstof, der blev brugt tidligere til billeddannelse, ved hjælp af en γ tæller efter cytometricellesortering. Dette gør det muligt at bestemme den cellulære oprindelse af det radioaktivt mærkede protein med høj cellulær specificitet og følsomhed. For eksempel viste undersøgelser med FACS-RTT, at (i) stigningen i TSPO-binding var forbundet med microglia i en rottemodel af lipopolysaccharid (LPS)-induceret neuroinflammation, (ii) en stigning i TSPO-binding ved 12- og 18-måneder var først forbundet med astrocytter og derefter mikroglia i TgF344-AD-rotter sammenlignet med vildtyperotter (WT) og (iii) striataldensiteten af 5HT2A R falder i astrocytter efter 18 måneder i samme rotte AD-model. Interessant nok kan denne teknik udvides til stort set alle radiotracere.
Neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom (AD), er karakteriseret ved et neuronalt tab forbundet med øgede symptomer. AD, den mest almindelige årsag til demens, der tegner sig for 60%-70% af tilfældene, påvirker omkring 50 millioner mennesker verden over1. På et neuropatologisk niveau er de to vigtigste egenskaber ved AD akkumuleringen af ekstracellulære amyloid-β (Aβ) plaques og intracellulære Tau neurofibrillære tangles. Gliacelleændringer har også været forbundet med AD2 og mulig forstyrrelse af flere neurotransmittersystemer 3,4.
TgF344-AD rottelinjen er blevet modificeret til model AD ved at udtrykke humane APP- og PS1ΔE9-transgener, hvilket fører til opløselig og uopløselig Aβ-40 og Aβ-42-ekspression og amyloidplaquedannelse5. Det præsenterer også akkumuleringen af hyperphosphorylerede former for Tau-proteinet, der fører til tauopati. Fra en alder af 9-24 måneder udvikler rotterne gradvist de patologiske kendetegn ved AD og en kognitiv svækkelse 5,6,7,8,9.
Positronemissionstomografi (PET), enkeltfotonemission computertomografi (SPECT) og autoradiografi er teknikker baseret på emission og kvantificering af γ stråler. Radiotracere kvantificeres enten in vivo (PET og SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Disse følsomme teknikker har bidraget til forståelsen af mekanismer i flere hjernesygdomme, såsom AD. Med hensyn til neuroinflammation er der faktisk mange undersøgelser, der vurderer 18 kDa Translocator Protein (TSPO), en in vivo neuroinflammationsmarkør, med radioaktivt mærkede sporstoffer såsom [11C] -(R) -PK11195 eller [11C] PBR28 (for gennemgang se10). Derudover er ændringer af neurotransmittersystemer blevet undersøgt ved hjælp af radiotracere 11,12,13.
Disse teknikker bestemmer imidlertid ikke det radioaktive signals cellulære oprindelse. Dette kan hæmme fortolkningen af det biologiske grundlag for ændringen i bindingen af en radioligand i PET/SPECT. For eksempel i tilfælde af TSPO-undersøgelser af neuroinflammation er det af afgørende betydning at forstå, om stigningen eller faldet i TSPO skyldes astrocytiske eller mikrogliale ændringer. Teknikken Fluorescensaktiveret cellesortering til radioligandbehandlet væv (FACS-RTT) blev udviklet for at omgå disse problemer, hvilket muliggør vurdering af radioligandbinding i hver celletype separat og kvantificering af målproteintætheden pr. Celle. Denne innovative teknik er derfor komplementær og yderst kompatibel med PET- og SPECT-billeddannelse.
Her blev denne teknik anvendt langs to akser: undersøgelsen af neuroinflammation ved hjælp af TSPO-specifikke radioligands og vurdering af det serotonerge system. På den første akse var målet at forstå TSPO-signalets cellulære oprindelse som reaktion på en akut inflammatorisk reaktion. Derfor blev FACS-RTT anvendt på hjernevæv hos rotter efter induktion af neuroinflammation via en lipopolysaccharid (LPS) injektion og efter en in vivo [125I] CLINDE SPECT billeddannelsesundersøgelse. Desuden blev den samme billeddannelses- og FACS-RTT-protokol anvendt på 12- og 24 måneder gamle TgF344-AD-rotter og matchende vildtyperotter (WT). Den anden akse havde til formål at bestemme oprindelsen af serotoninerge systemændringer i denne rottemodel via ex vivo 5-HT2AR-densitetsvurdering efter celletype.
Så vidt vi ved, var denne teknik den første til at beskrive en tilgang, der muliggør en bedre forståelse af in vivo-bindende ændringer af en radiotracer på celleniveau. Protokollen beskriver en multiskala metode til kvantificering af radiotracerbinding på celleniveau ved hjælp af [125I] CLINDE (TSPO) eller [125I] R91150 (5HT2AR) som eksempler.
Denne teknik er robust og følsom nok til præcist at detektere den cellulære oprindelse af et bredt …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (bevilling nr. 320030-184713). Forfatterne BBT og KC er støttet af Velux Fonden (projekt n. 1123). Forfatter ST modtog støtte fra Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus stipendium) og Jean og Madeleine Vachoux Foundation.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
HPLC | Knauer | ||
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
R91150 précursor | CERMN | ||
Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
Tributylin precursor | CERMN | ||
U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |