Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo
Summary
Fluorescência-Ativada Célula-Radioliging tecido tratado (FACS-RTT) é uma ferramenta poderosa para estudar o papel da proteína translocador de 18 kDa ou expressão de receptor de serotonina 5HT2A na doença de Alzheimer em escala celular. Este protocolo descreve a aplicação ex-vivo do FACS-RTT no modelo de rato TgF344-AD.
Abstract
As células gliais provavelmente têm uma implicação considerável na fisiopatologia de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (DA). Suas alterações talvez estejam associadas a um estado pró-inflamatório. A linhagem de ratos TgF344-AD foi projetada para expressar genes humanos app e humanos PS1ΔE9 , codificando proteínas amiloides Aβ-40 e Aβ-42 e exibe patologia amiloide e déficits cognitivos com envelhecimento. O modelo de rato TgF344-AD é usado neste estudo para avaliar a origem celular da ligação de 18 kDa translocator protein (TSPO, um marcador de ativação celular gliana) e os níveis de receptor de serotonina 5HT2A receptor (5HT2AR) que são possivelmente interrompidos em DDA. A técnica aqui apresentada é Fluorescência-Ativada Classificação celular para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT), uma técnica quantitativa específica do tipo celular complementar às técnicas in vivo PET ou SPECT ou ex vivo/in vitro autoradiography. Ele quantifica o mesmo rastreador radiolabeled usado antes para a imagem, usando um contador de γ após a triagem de células de citometria. Isso permite determinar a origem celular da proteína radiolabeled com alta especificidade celular e sensibilidade. Por exemplo, estudos com FACS-RTT mostraram que (i) o aumento da ligação TSPO estava associado à microglia em um modelo de ratinaide de lipopolysacarídeo (LPS)-induzido neuroinflamação, (ii) um aumento na ligação TSPO em 12 e 18 meses foi associado primeiro com astrócitos, e depois microglia nos ratos TgF344-AD em comparação com ratos do tipo selvagem (WT) e (iii) a densidade estriatal de 5HT2A R diminui em astrócitos aos 18 meses no mesmo modelo de AD de rato. Curiosamente, essa técnica pode ser estendida a praticamente todos os radiotracers.
Introduction
Doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA), são caracterizadas por uma perda neuronal associada ao aumento dos sintomas. AD, a causa mais comum de demência, representando 60%-70% dos casos, afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo1. Em um nível neuropatológico, as duas principais características da DA são o acúmulo de placas extracelulares amilóide-β (Aβ) e emaranhados neurofibrilaris Tau intracelulares. Alterações celulares gliais também foram associadas à AD2 e possível interrupção de vários sistemas neurotransmissores 3,4.
A linha de ratos TgF344-AD foi modificada para modelar AD expressando transgenes humanos APP e PS1ΔE9, levando à expressão solúvel e insolúvel Aβ-40 e Aβ-42 e formação de placa amiloide5. Também apresenta o acúmulo de formas hiperfosforilaladas da proteína Tau que levam à tauopatia. Dos 9 a 24 meses, os ratos desenvolvem progressivamente as características patológicas da DA e um comprometimento cognitivode 5,6,7,8,9.
Tomografia de Emissão de Pósitrons (PET), Tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e autoradiografia são técnicas baseadas na emissão e quantificação de raios γ. Os radiotracers são quantificados tanto in vivo (PET e SPECT) quanto ex vivo/in vitro (autoradiografia). Essas técnicas sensíveis têm contribuído para a compreensão de mecanismos de várias doenças cerebrais, como a DA. De fato, em termos de neuroinflamação, há muitos estudos avaliando 18 kDa Translocator Protein (TSPO), um marcador de neuroinflamação in vivo, com rastreadores radiolabeled como [11C]-(R)-PK11195 ou [11C]PBR28 (para revisão ver10). Além disso, alterações nos sistemas neurotransmissores têm sido estudadas utilizando radiotracers 11,12,13.
No entanto, essas técnicas não determinam a origem celular do sinal radioativo. Isso poderia dificultar a interpretação dos fundamentos biológicos da alteração na vinculação de um radiolig e no PET/SPECT. Por exemplo, no caso de estudos tspo de neuroinflamação, entender se o aumento ou diminuição do TSPO é devido a alterações astróciticas ou microgliais é de suma importância. A técnica de Triagem celular ativada pela Fluorescência para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT) foi desenvolvida para contornar esses problemas, permitindo a avaliação da radioligência e vinculação em cada tipo de célula separadamente e a quantificação da densidade de proteína-alvo por célula. Esta técnica inovadora é, consequentemente, complementar e altamente compatível com imagens PET e SPECT.
Aqui, essa técnica foi aplicada ao longo de dois eixos: o estudo da neuroinflamação utilizando radioligands específicos do TSPO e avaliação do sistema serotonérgico. No primeiro eixo, o objetivo era compreender a origem celular do sinal TSPO em resposta a uma reação inflamatória aguda. Portanto, o FACS-RTT foi utilizado nos tecidos cerebrais dos ratos após a indução da neuroinflamação por meio de uma injeção de lipopólise (LPS) e após um estudo de imagem in vivo [125I]CLINDE SPECT. Além disso, o mesmo protocolo de imagem e FACS-RTT foram aplicados em ratos TgF344-AD de 12 e 24 meses de idade e ratos do tipo selvagem (WT) correspondentes. O segundo eixo visava determinar a origem das alterações do sistema serotoninérgico neste modelo de rato através da avaliação de densidade ex vivo 5-HT2AR por tipo de célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para nosso conhecimento, essa técnica foi a primeira a descrever uma abordagem que permite uma melhor compreensão das alterações in vivo de ligação de um radiotracer no nível celular. O protocolo descreve um método multiescala para quantificar a ligação radiotracer no nível celular usando [125I]CLINDE (TSPO) ou [125I]R91150 (5HT2AR) como exemplos.
Esta técnica é robusta e sensível o suficiente para detectar precisamente a origem celular d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (bolsa nº 320030-184713). Os autores BBT e KC são apoiados pela Fundação Velux (projeto nº 1123). A Author ST recebeu apoio da Fundação Nacional de Ciência suíça (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), a Fundação Prof. Dr. Max Cloetta (bolsa de estudos Clínica Medicine Plus) e a Fundação Jean e Madeleine Vachoux.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
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