Clasificación celular activada por fluorescencia-tejido tratado con radioligando (FACS-RTT) para determinar el origen celular de la señal radiactiva
Summary
Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) es una poderosa herramienta para estudiar el papel de la proteína translocadora de 18 kDa o la expresión del receptorserotonina 5HT 2A en la enfermedad de Alzheimer a escala celular. Este protocolo describe la aplicación ex-vivo de FACS-RTT en el modelo de rata TgF344-AD.
Abstract
Las células gliales probablemente tienen una implicación considerable en la fisiopatología de los trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA). Sus alteraciones están quizás asociadas a un estado proinflamatorio. La cepa de rata TgF344-AD ha sido diseñada para expresar los genes humanos APP y PS1ΔE9 humanos, codificando para las proteínas amiloides Aβ-40 y Aβ-42 y muestra patología amiloide y déficits cognitivos con el envejecimiento. El modelo de rata TgF344-AD se utiliza en este estudio para evaluar el origen celular de la unión a la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO, un marcador de activación de células gliales) y los niveles del receptor de serotonina 5HT2A (5HT2AR) que posiblemente se interrumpen en la EA. La técnica que aquí se presenta es Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), una técnica cuantitativa específica de tipo celular complementaria a las técnicas in vivo de PET o SPECT o autorradiografía ex vivo/in vitro . Cuantifica el mismo trazador radiomarcado utilizado anteriormente para la obtención de imágenes, utilizando un contador de γ después de la clasificación celular por citometría. Esto permite determinar el origen celular de la proteína radiomarcada con alta especificidad y sensibilidad celular. Por ejemplo, los estudios con FACS-RTT mostraron que (i) el aumento en la unión a TSPO se asoció con microglia en un modelo de rata de neuroinflamación inducida por lipopolisacáridos (LPS), (ii) un aumento en la unión a TSPO a los 12 y 18 meses se asoció con astrocitos primero, y luego microglia en las ratas TgF344-AD en comparación con ratas de tipo salvaje (WT), y (iii) la densidad estriatal de 5HT2A R disminuye en los astrocitos a los 18 meses en el mismo modelo de EA de rata. Curiosamente, esta técnica se puede extender a prácticamente todos los radiotrazadores.
Introduction
Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), se caracterizan por una pérdida neuronal asociada con un aumento de los síntomas. La EA, la causa más común de demencia, que representa el 60%-70% de los casos, afecta a alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo1. A nivel neuropatológico, las dos características principales de la EA son la acumulación de placas extracelulares de β amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares intracelulares de Tau. Las alteraciones de las células gliales también se han asociado con la EA2 y la posible interrupción de varios sistemas de neurotransmisores 3,4.
La línea de ratas TgF344-AD ha sido modificada para modelar AD expresando transgenes humanos APP y PS1ΔE9, lo que lleva a la expresión soluble e insoluble de Aβ-40 y Aβ-42 y a la formación de placa amiloide5. También presenta la acumulación de formas hiperfosforiladas de la proteína Tau que conducen a la tauopatía. A partir de los 9-24 meses de edad, las ratas desarrollan progresivamente las señas de identidad patológicas de la EA y un deterioro cognitivo 5,6,7,8,9.
La tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y la autorradiografía son técnicas basadas en la emisión y cuantificación de rayos γ. Los radiotrazadores se cuantifican in vivo (PET y SPECT) o ex vivo/in vitro (autorradiografía). Esas técnicas sensibles han contribuido a la comprensión de los mecanismos de varias enfermedades cerebrales, como la EA. De hecho, en términos de neuroinflamación, hay muchos estudios que evalúan la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO), un marcador de neuroinflamación in vivo, con trazadores radiomarcados como [11C]-(R)-PK11195 o [11C]PBR28 (para revisión ver10). Además, se han estudiado alteraciones de los sistemas de neurotransmisores utilizando radiotrazadores 11,12,13.
Sin embargo, esas técnicas no determinan el origen celular de la señal radiactiva. Esto podría dificultar la interpretación de los fundamentos biológicos de la alteración en la unión de un radioligando en PET/SPECT. Por ejemplo, en el caso de los estudios de neuroinflamación de TSPO, comprender si el aumento o la disminución de TSPO se debe a cambios astrocíticos o microgliales es de suma importancia. La técnica Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) se desarrolló para solucionar estos problemas, permitiendo la evaluación de la unión de radioligando en cada tipo de célula por separado y la cuantificación de la densidad de proteína objetivo por célula. Esta innovadora técnica es, en consecuencia, complementaria y altamente compatible con las imágenes PET y SPECT.
Aquí, esta técnica se aplicó a lo largo de dos ejes: el estudio de la neuroinflamación utilizando radioligandos específicos de TSPO y la evaluación del sistema serotoninérgico. En el primer eje, el objetivo fue comprender el origen celular de la señal TSPO en respuesta a una reacción inflamatoria aguda. Por lo tanto, FACS-RTT se utilizó en los tejidos cerebrales de ratas después de la inducción de la neuroinflamación a través de una inyección de lipopolisacáridos (LPS) y después de un estudio de imágenes IN VIVO [125I]CLINDE SPECT. Además, se aplicaron las mismas imágenes y el protocolo FACS-RTT en ratas TgF344-AD de 12 y 24 meses de edad y ratas de tipo salvaje (WT) coincidentes. El segundo eje tuvo como objetivo determinar el origen de las alteraciones del sistema serotoninérgico en este modelo de rata a través de la evaluación ex vivo de la densidad 5-HT2AR por tipo de célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta donde sabemos, esta técnica fue la primera en describir un enfoque que permite una mejor comprensión de las alteraciones de unión in vivo de un radiotrazador a nivel celular. El protocolo describe un método multiescala para cuantificar la unión al radiotrazador a nivel celular utilizando [125I]CLINDE (TSPO) o [125I]R91150 (5HT2AR) como ejemplos.
Esta técnica es lo suficientemente robusta y sensible como para detectar con precisión el orige…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subvención nº 320030-184713). Los autores BBT y KC cuentan con el apoyo de la Fundación Velux (proyecto n. 1123). El autor ST recibió el apoyo de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fundación Prof. Dr. Max Cloetta (beca Clinical Medicine Plus) y la Fundación Jean y Madeleine Vachoux.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
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