Summary
Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) es una poderosa herramienta para estudiar el papel de la proteína translocadora de 18 kDa o la expresión del receptorserotonina 5HT 2A en la enfermedad de Alzheimer a escala celular. Este protocolo describe la aplicación ex-vivo de FACS-RTT en el modelo de rata TgF344-AD.
Abstract
Las células gliales probablemente tienen una implicación considerable en la fisiopatología de los trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA). Sus alteraciones están quizás asociadas a un estado proinflamatorio. La cepa de rata TgF344-AD ha sido diseñada para expresar los genes humanos APP y PS1ΔE9 humanos, codificando para las proteínas amiloides Aβ-40 y Aβ-42 y muestra patología amiloide y déficits cognitivos con el envejecimiento. El modelo de rata TgF344-AD se utiliza en este estudio para evaluar el origen celular de la unión a la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO, un marcador de activación de células gliales) y los niveles del receptor de serotonina 5HT2A (5HT2AR) que posiblemente se interrumpen en la EA. La técnica que aquí se presenta es Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), una técnica cuantitativa específica de tipo celular complementaria a las técnicas in vivo de PET o SPECT o autorradiografía ex vivo/in vitro . Cuantifica el mismo trazador radiomarcado utilizado anteriormente para la obtención de imágenes, utilizando un contador de γ después de la clasificación celular por citometría. Esto permite determinar el origen celular de la proteína radiomarcada con alta especificidad y sensibilidad celular. Por ejemplo, los estudios con FACS-RTT mostraron que (i) el aumento en la unión a TSPO se asoció con microglia en un modelo de rata de neuroinflamación inducida por lipopolisacáridos (LPS), (ii) un aumento en la unión a TSPO a los 12 y 18 meses se asoció con astrocitos primero, y luego microglia en las ratas TgF344-AD en comparación con ratas de tipo salvaje (WT), y (iii) la densidad estriatal de 5HT2A R disminuye en los astrocitos a los 18 meses en el mismo modelo de EA de rata. Curiosamente, esta técnica se puede extender a prácticamente todos los radiotrazadores.
Introduction
Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), se caracterizan por una pérdida neuronal asociada con un aumento de los síntomas. La EA, la causa más común de demencia, que representa el 60%-70% de los casos, afecta a alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo1. A nivel neuropatológico, las dos características principales de la EA son la acumulación de placas extracelulares de β amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares intracelulares de Tau. Las alteraciones de las células gliales también se han asociado con la EA2 y la posible interrupción de varios sistemas de neurotransmisores 3,4.
La línea de ratas TgF344-AD ha sido modificada para modelar AD expresando transgenes humanos APP y PS1ΔE9, lo que lleva a la expresión soluble e insoluble de Aβ-40 y Aβ-42 y a la formación de placa amiloide5. También presenta la acumulación de formas hiperfosforiladas de la proteína Tau que conducen a la tauopatía. A partir de los 9-24 meses de edad, las ratas desarrollan progresivamente las señas de identidad patológicas de la EA y un deterioro cognitivo 5,6,7,8,9.
La tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y la autorradiografía son técnicas basadas en la emisión y cuantificación de rayos γ. Los radiotrazadores se cuantifican in vivo (PET y SPECT) o ex vivo/in vitro (autorradiografía). Esas técnicas sensibles han contribuido a la comprensión de los mecanismos de varias enfermedades cerebrales, como la EA. De hecho, en términos de neuroinflamación, hay muchos estudios que evalúan la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO), un marcador de neuroinflamación in vivo, con trazadores radiomarcados como [11C]-(R)-PK11195 o [11C]PBR28 (para revisión ver10). Además, se han estudiado alteraciones de los sistemas de neurotransmisores utilizando radiotrazadores 11,12,13.
Sin embargo, esas técnicas no determinan el origen celular de la señal radiactiva. Esto podría dificultar la interpretación de los fundamentos biológicos de la alteración en la unión de un radioligando en PET/SPECT. Por ejemplo, en el caso de los estudios de neuroinflamación de TSPO, comprender si el aumento o la disminución de TSPO se debe a cambios astrocíticos o microgliales es de suma importancia. La técnica Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) se desarrolló para solucionar estos problemas, permitiendo la evaluación de la unión de radioligando en cada tipo de célula por separado y la cuantificación de la densidad de proteína objetivo por célula. Esta innovadora técnica es, en consecuencia, complementaria y altamente compatible con las imágenes PET y SPECT.
Aquí, esta técnica se aplicó a lo largo de dos ejes: el estudio de la neuroinflamación utilizando radioligandos específicos de TSPO y la evaluación del sistema serotoninérgico. En el primer eje, el objetivo fue comprender el origen celular de la señal TSPO en respuesta a una reacción inflamatoria aguda. Por lo tanto, FACS-RTT se utilizó en los tejidos cerebrales de ratas después de la inducción de la neuroinflamación a través de una inyección de lipopolisacáridos (LPS) y después de un estudio de imágenes IN VIVO [125I]CLINDE SPECT. Además, se aplicaron las mismas imágenes y el protocolo FACS-RTT en ratas TgF344-AD de 12 y 24 meses de edad y ratas de tipo salvaje (WT) coincidentes. El segundo eje tuvo como objetivo determinar el origen de las alteraciones del sistema serotoninérgico en este modelo de rata a través de la evaluación ex vivo de la densidad 5-HT2AR por tipo de célula.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité de Ética para la Experimentación Humana y Animal del Cantón de Ginebra, la Comisión Cantonal de Ética de la Investigación (CCER) y la Dirección General de Salud del Cantón de Ginebra (Suiza), respectivamente. Los datos se informan siguiendo las pautas de Investigación en Animales: Informes de Experimentos In-vivo (ARRIVE).
1. Preparación y calibración de la cámara SPECT
- Encienda la cámara, cargue el software operativo (consulte la Tabla de materiales). Haga clic en el botón Home XYZ Stage para realizar el homing.
- Configure el experimento compuesto por una adquisición de escaneo de 10 minutos. Establezca el modo Step en Fine y el modo Acquisition en Listmode (para registrar todo el espectro de emisión).
- Configure la cama y asegúrese de que el sistema de calentamiento, el sensor de respiración y la anestesia sean funcionales y seguros (Figura 1A-D). Luego, coloque un fantasma (es decir, 2 ml de una concentración conocida de 125I en un tubo de microfuge de 2 ml) donde se colocará la cabeza del animal (centrada en el área, Figura 1E).
- Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores para las tres dimensiones con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla. Asegúrese de que el volumen de escaneo del fantasma y el animal sea el mismo.
- Inicie el escaneo fantasma para su posterior calibración con los parámetros establecidos en los pasos 1.2-1.4.
2. Configuración del espacio de trabajo para imágenes SPECT
- Limpie el espacio de trabajo con virucida desinfectante y coloque papeles blandos en todas las superficies.
- Asegúrese de que haya suficiente isoflurano y oxígeno en sus respectivos tanques.
- Prepare un catéter de 24 G cortando las aletas del catéter de mariposa para tener una visión más clara de la vena de la cola de rata.
- Cubra el catéter llenándolo completamente con solución de heparina (25000 U/mL) después de retirar la aguja. Luego, vuelva a colocar la aguja en ella para evitar la formación de coágulos de sangre después de la inserción del catéter.
3. [125I]Síntesis del radiotrazador CLINDE
PRECAUCIÓN: La radiactividad puede tener suficiente energía ionizante para afectar a los átomos de las células vivas y dañar su material genético (ADN).
- Asegurarse de trabajar en un entorno apropiado, autorizado para experimentos que involucren radiactividad.
NOTA: Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado para el manejo de la radiactividad, incluidos los dosímetros de dedos y cuerpo. Trate de mantenerse a una distancia segura de cualquier fuente de radiactividad. - Incubar 100 μg de precursor de tributilina en 100 μL de ácido acético con yoduro de sodio (Na125I) (ver Tabla de Materiales) y 5 μL de ácido peracético al 37% a 70 °C durante 20 min en un termociclador colocado en una guantera.
- Diluir la reacción utilizando 50% de acetonitrilo (ACN) en agua para alcanzar un volumen de 500 μL. Inyectar los 500 μL de la reacción diluida en una columna de fase inversa (ver Tabla de Materiales).
- Aísle el [125I]CLINDE con un hpLC de gradiente lineal que se ejecuta desde 5%-95% ACN en 7 mM H3PO4 durante 10 min. Diluya el aislado en H2O para alcanzar un volumen final de 10 ml, y luego inyecte la reacción diluida en una columna de concentración (consulte la Tabla de materiales).
- Eluya el [125I]CLINDE de la columna con 300 μL de etanol absoluto, y luego evapore el etanol incubándolo en una centrífuga al vacío en RT durante 40 min.
- Diluir el residuo que contiene el [125I]CLINDE en 300 μL de solución salina estéril para crear una solución madre.
- Después de medir su radiactividad, diluir la solución madre en solución salina estéril para obtener una solución de 0,037 MBq en 500 μL.
- Purificar el trazador mediante HPLC (Cromatografía líquida de alto rendimiento). Determine el tiempo de elución utilizando una calibración estándar a 450 nm y aísle el pico radiactivo único. Realizar la curva de calibración estándar utilizando siete concentraciones estándar de CLINDE frío (no radiactivo) (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg y 5 μg en 400 μL de una solución de ACN al 50%). Establecer la pureza radioquímica midiendo un solo pico en radio TLC (Cromatografía de Capa Fina). Asegúrese de que la pureza del radioquímico sea superior al 60%.
- Comprobar la actividad específica del radioligando midiendo la absorbancia ultravioleta a 450 nm y las curvas de calibración establecidas con compuestos de referencia en frío. Asegúrese de que la actividad específica sea superior a 1000 GBq/μmol.
4. [125I]R91150 síntesis de radiotrazadores
NOTA: Asegúrese de seguir las mismas reglas de seguridad que se mencionan en la sección de síntesis de CLINDE.
- Mezclar 300 μg de precursor R91150 en una solución de 3 μL de etanol absoluto, 3 μL de ácido acético glacial, 15 μL de Na125I libre de portadores (ver Tabla de Materiales) (10 mCi) en 0,05 M NaOH y 3 μL de 30% H2O2. Incubar durante 30 min en una guantera.
- Inyecte toda la reacción en una columna de fase inversa (consulte la Tabla de materiales).
- Aislar [125I]R91150 por funcionamiento isocrático de HPLC (ACN/agua 50/50, tampón de ácido acético de 10 mM) con un caudal de 3 mL/min.
- Diluir [125I]R91150 en H2O para un volumen final de 10 mL.
- Inyecte 10 ml de la reacción diluida en una columna de concentración (consulte la Tabla de materiales).
- Elute [125I]R91150 de la columna con 300 μL de etanol absoluto.
- Evaporar el etanol incubándolo en una centrífuga al vacío en RT durante 40 min.
- Diluir el residuo que contiene [125I]R91150 en 300 μL de solución salina.
- Purificar el trazador mediante HPLC. Determine el tiempo de elución utilizando una calibración estándar a 450 nm y aísle el pico radiactivo único. Establezca la pureza radioquímica midiendo un solo pico en radio TLC. Asegúrese de que la pureza del radioquímico sea superior al 98%.
5. Preparación animal
- Pesar y anestesiar la rata TgF344-AD (macho o hembra, de 2-24 meses de edad) en una cámara de inducción con 3% de isoflurano. Una vez anestesiado profundamente, reduzca el flujo de isoflurano al 2% (0,4 L/min, 100% O2) en la cámara.
- Coloque al animal en una cama precalentada equipada con una anestesia nosecone. Mantener el isoflurano al 2% (0,4 L/min, 100% O2).
- Aplique lubricante de gel para los ojos en los ojos del animal y confirme la profundidad de la anestesia a través de la monitorización respiratoria; ajustar la anestesia si es necesario.
- Realizar la inserción del catéter de 24 G en la vena de la cola.
6. Adquisición de SPECT
- Transfiera el animal a la cama de la cámara equipada con una almohadilla térmica de temperatura controlada a 38 ° C (Figura 1E).
- Asegure la cabeza del animal en la barra de mordida y fije los soportes de la cabeza.
- Configure el experimento en un escaneo de 60 minutos que constituye 60 cuadros de 1 minuto. Reutilice todos los demás parámetros configurados en el paso 1. Haga clic en el botón Actualizar imagen para actualizar la posición del animal.
- Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla para las tres dimensiones.
- Inyecte 500 μL del radiotrazador radiactivo ([125I]CLINDE o [125I]R91150) y, a continuación, enjuague el tubo con 300 μL de NaCl estéril al 0,9%. Haga clic simultáneamente en Iniciar adquisición para iniciar el escaneo.
- Durante el tiempo de escaneo, asegúrese de mantener al animal bajo anestesia constante con monitoreo de la frecuencia respiratoria. Ajuste el flujo de isoflurano si es necesario.
- Una vez que termine la exploración, eutanasia rápidamente al animal anestesiado por decapitación.
7. Reconstrucción del escaneo
- Abra el software de reconstrucción del análisis (consulte Tabla de materiales) y, a continuación, abra el conjunto de datos, buscando el archivo [filename].parameters, creado en la carpeta del análisis.
- Seleccione el isótopo de interés. Tenga en cuenta que el parámetro Listmode permite la selección de varios isótopos en este paso.
- Seleccione los siguientes parámetros: tamaño de vóxel de 0,4 mm, 4 subconjuntos (POS-EM), 6 iteraciones (equivalente a 24ME-EM), sin postfiltro y el isótopo correspondiente corrección de desintegración. Seleccione el formato de salida de NIfTI y, a continuación, seleccione Iniciar reconstrucción SPECT .
8. Extracción del cerebro de la rata
- En el mismo evento anestésico que el procedimiento de exploración y después de asegurar el estado de anestesia profunda del animal mediante el monitoreo de su frecuencia respiratoria, proceda a la decapitación por guillotina y transfiera rápidamente la cabeza al banco de disección.
- Con tijeras, corte cuidadosamente la piel en la parte superior de la cabeza desde la parte posterior hasta el frente hasta la mitad de los ojos.
- Corte el exceso de músculos alrededor de la base del cráneo y las vértebras cervicales.
- A continuación, coloque cuidadosamente una hoja de las tijeras en el orificio en la parte posterior del cráneo, el foramen magnum, y retire la parte posterior del cráneo con alicates quirúrgicos.
- Luego, con alicates quirúrgicos, retire cuidadosamente la parte superior del cráneo. El cráneo de las ratas macho viejas puede ser grueso, eliminar como pequeños trozos para evitar daños en el cerebro.
- Corta cuidadosamente las meninges con tijeras. Las meninges pueden dañar el cerebro durante el proceso de extracción; retírelo como medida de precaución.
- Después de extraer la parte superior del cráneo, gire la cabeza del animal alrededor y, con una pequeña espátula plana, extraiga cuidadosamente el cerebro cortando los nervios óptico y trigémino.
- Transfiera cuidadosamente el cerebro a una superficie de vidrio plana y limpia para la disección en hielo.
- Use una espátula de metal plana y una cuchilla de afeitar para diseccionar las regiones de interés del cerebro. Coloque los tejidos en un tubo centrífugo de 2 ml y pese el tejido obtenido. Use la sección cerebral directamente para el aislamiento celular o congélela rápidamente en nitrógeno líquido para su uso posterior.
9. Aislamiento celular
- Asegúrese de trabajar en un ambiente limpio y estéril. Se recomienda trabajar bajo un gabinete de bioseguridad (BSC) de clase II. Asegúrese de que los guantes y cada pieza de equipo introducida en el BSC sean estériles.
- Para preparar las células para la clasificación celular, siga el protocolo de Jaclyn M. Schwarz14.
NOTA: En este experimento, se utilizó un kit de disociación neuronal disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) para la preparación celular.- Coloque las muestras en un tubo centrífugo de 2 ml con 1 ml de HBSS (libre de Ca y Mg), y luego centrífuga (300 x g, 2 min, temperatura ambiente = RT) y retire el sobrenadante sin molestar el pellet.
- Añadir 1900 μL de mezcla de enzimas-1 e incubarlo durante 15 min a 37 °C mientras agitamos los tubos por inversión cada 5 min.
- Agregue 30 μL de mezcla de enzimas-2, agite suavemente con la pipeta 1 (ver Tabla de materiales) hacia adelante y hacia atrás 30 veces. Luego, incubar durante 15 min a 37 °C mientras agitamos los tubos por inversión cada 5 min.
- Mezclar suavemente hacia adelante y hacia atrás con la pipeta 2, y luego la pipeta 3 antes de incubar durante 10 min a 37 °C para disociar los tejidos.
- Filtre las células con un colador de células de 80 μm, agregue 10 ml de HBSS (libre de Ca y Mg). Centrifugar (300 x g, 10 min, RT) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet.
- Para el agotamiento de la mielina, vuelva a suspender el pellet con 400 μL de tampón de eliminación de mielina (consulte la Tabla de materiales) y luego agregue 100 μL de perlas de eliminación de mielina (consulte la Tabla de materiales), antes de incubar durante 15 min a 4 ° C.
- Agregue 5 ml de tampón de eliminación de mielina, centrífuga (300 x g, 10 min, RT) y retire el sobrenadante sin molestar el pellet.
- Agregue 500 μL de tampón de eliminación de mielina y coloque el tubo en la columna de campo magnético. Lave la columna con 1 ml de tampón de eliminación de mielina cuatro veces.
- Centrifugar (300 x g, 2 min, RT) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Vórtice brevemente (2 s) para disociar las células y añadir 5 μL de fc bloque CD32. Vórtice de nuevo e incube durante 5 min a 4 °C.
- Añadir 100 μL de la mezcla de anticuerpos primarios de interés; incubar durante 20 min a 4 °C.
- Centrifugar (350 x g, 5 min, 4 °C) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Seque los tubos boca abajo en papel blando.
- Después de un breve vórtice (2 s), agregue 100 μL de la mezcla secundaria de anticuerpos e incube durante 15 min a 4 °C.
- Añadir 2 ml de tampón de eliminación de mielina, centrífuga (350 x g, 5 min, 4 °C) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Seque los tubos boca abajo en papel blando. Resuspend las células en 250 μL de PBS estéril y proceder directamente a la clasificación celular.
10. Clasificación de celdas
- Prepare el tubo de microfuge con 500 μL de PBS estéril para recolectar las células clasificadas.
- Agregue 10 μL de Hoechst por 1000 μL de solución celular para colorear los núcleos de las células vivas y distinguirlos de las células muertas.
- Transfiera las células lo antes posible a la máquina clasificadora de células a 4 °C.
- Primero, ordene las celdas por dispersión hacia adelante y hacia el lado, y luego ordene las celdas positivas de Hoechst. A continuación, ordene las células en función de los anticuerpos de interés. Recoja las células teñidas positivamente por separado. Asegúrese de distinguir las células positivas de las autofluorescentes.
- Cuente el número de celdas ordenadas para cada grupo de interés.
11. Conteo gamma
- Calibrar el sistema de conteo de γ con 10 μL de la misma solución fantasma utilizada para la calibración SPECT pero diluirlo en 1 mL de agua.
NOTA: La solución fantasma se diluye debido a la mayor precisión del sistema de conteo de γ. - Coloque el tubo de células clasificadas en el sistema de conteo de γ y proceda con el conteo γ de acuerdo con el protocolo del fabricante.
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Representative Results
Las ratas WT experimentaron exploración SPECT in vivo con radiotrazador [125I]CLINDE después de una inyección unilateral de LPS (Figura 2). Esta exploración (utilizando datos sumados de imágenes de 45-60 min después de la inyección de radiotrazador) mostró una mayor unión de [125I]CLINDE en el sitio de la inyección de LPS (Figura 2A) que en la región contralateral del cerebro (Figura 2B). Las muestras ex vivo que se sometieron a FACS-RTT confirmaron esos resultados y revelaron la presencia de un mayor número de [125I]sitios de unión a CLINDE solo en microglia, mostrando que el origen celular de la señal [125I]CLINDE en el lado ipsilateral del cerebro fue microglial (Figura 3A)15.
Usando el mismo radiotrazador [125I]CLINDE, el protocolo se realizó en el hipocampo de ratas TgF344-AD viejas (12 y 24 meses de edad) y se comparó con WT de 24 meses de edad. Los resultados demostraron que el aumento en la unión a TSPO a los 12 meses en ratas TgF344-AD se restringió a los astrocitos. En ratas de 24 meses de edad, el aumento en la unión a TSPO se debió a alteraciones astrocíticas y microgliales (Figura 3B). Los resultados mostraron que la sobreexpresión de TSPO en los astrocitos probablemente se observa antes que la microglial. De forma independiente, utilizando el radiotrazador [125I]R91150, esta técnica se utilizó a escala celular para demostrar que en ratas TgF344-AD más antiguas, los astrocitos estriatales mostraron una densidad disminuida de 5HT2AR en comparación con WT (Figura 3C)16.
Finalmente, FACS-RTT se realizó en muestras humanas de AD post mortem. Después de la disociación, las células se incubaron con [125I]CLINDE antes de la tinción y el procedimiento FACS. Esto permitió descubrir una sobreexpresión cortical de TSPO tanto en astrocitos como en microglía de sujetos con EA en comparación con controles de la misma edad (Figura 3D).
Figura 1: Configuración de la cámara SPECT. (A) Presentación general de la cámara SPECT. (B) Presentación de la cama con calentador y monitoreo de la frecuencia respiratoria. (C) Tapones de tubo de anestesia. (D) Lecho calefactor y cavidad de sonda respiratoria. (E) Vista de monitoreo de posicionamiento fantasma desde el software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes cerebrales TSPO mediante SPECT con radiotrazador [125I]CLINDE. Imágenes representativas (45-60 min después de la inyección de [125I]CLINDE) del hipocampo después de (A) LPS o (B) inyección de solución salina en el lado ipsilateral (blanco) y contralateral (rojo) del cerebro. Las curvas de tiempo-actividad in vivo medidas en el volumen de interés se representan en el panel derecho. SPECT: tomografía computarizada por emisión de fotón único; TSPO: proteína translocadora; LPS: lipopolisacárido. n = 7 animales por condición. Esta cifra ha sido modificada a partir de Tournier et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de TSPO y 5HT2AR. (A) Origen celular de la sobreexpresión de TSPO después de una inyección cerebral unilateral de LPS. Se midió la radiactividad (% dosis inyectada/g de tejido) en cada población celular en el lado contralateral (gris, n = 7) e ipsilateral (verde, n = 7) de la inyección. Prueba estadística utilizada: prueba t pareada. (B) TSPO en rata vieja TgF344-AD. Las concentraciones de [125I]CLINDE (% dosis inyectada/g de tejido) se determinaron en animales salvajes de 24 meses de edad (gris, n = 9) y en ratas 12- (verde, n = 8) y 24 meses de edad (púrpura, n = 7) TgF344- AD. Prueba estadística utilizada: ANOVA bidireccional. (C) 5HT2AR está disminuido en astrocitos del cuerpo estriado en ratas TgF344-AD viejas. La concentración de [125I]R91150 se determinó en astrocitos y microglía a nivel celular (% dosis inyectada/célula) en ratas WT (gris, n = 7) y TgF344-AD viejas (verde, n = 11). Prueba estadística utilizada: ANOVA unidireccional. (D) Procedencia celular de la sobreexpresión de TSPO en la corteza frontal en la enfermedad de Alzheimer (EA). En cada población celular, se mide la radiactividad (% dosis inyectada/g de tejido) en sujetos con EA (verde, n = 9) y control (gris, n = 9). Prueba estadística utilizada: prueba t no apareada. Todos los datos se representan como IC medio ± 95% con la siguiente anotación: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hasta donde sabemos, esta técnica fue la primera en describir un enfoque que permite una mejor comprensión de las alteraciones de unión in vivo de un radiotrazador a nivel celular. El protocolo describe un método multiescala para cuantificar la unión al radiotrazador a nivel celular utilizando [125I]CLINDE (TSPO) o [125I]R91150 (5HT2AR) como ejemplos.
Esta técnica es lo suficientemente robusta y sensible como para detectar con precisión el origen celular de un amplio espectro de alteraciones de las células gliales que van desde una intensa reacción inflamatoria inducida por LPS hasta alteraciones celulares gliales más sutiles observadas en un modelo de rata de EA, aportando importante información complementaria a la neuroimagen nuclear in vivo , como el origen microglial de la señal obtenida con SPECT que se determinó. El estudio mostró además que FACS-RTT incluso fue capaz de discernir alteraciones de la densidad de neurorreceptores a escala celular con el ejemplo de 5HT2AR (Figura 3C). Finalmente, se proporcionó evidencia para el uso de la técnica en tejidos post mortem humanos, mostrando una mayor concentración de TSPO en astrocitos y microglía de sujetos con EA.
La principal ventaja de esta técnica es su complementariedad con las imágenes PET y SPECT. De hecho, las imágenes nucleares son una técnica poderosa que puede extraer información de una región del cerebro o nivel de vóxel. Sin embargo, su límite reside en la escala celular; es imposible distinguir la contribución de cada tipo de célula a la señal. FACS-RTT permite ir más allá al revelar una concentración de radiotrazador en cada tipo de célula. Curiosamente, en teoría, se puede evaluar un conjunto ilimitado de objetivos con esta técnica, la limitación es la disponibilidad de un radiotrazador para el objetivo de interés.
Los pasos críticos del protocolo incluyen el uso de radiactividad que debe realizarse en un entorno seguro con personal calificado. Además, es crucial considerar la desintegración radiactiva. Para la preparación de FACS, se debe garantizar la especificidad de los anticuerpos, la longitud de onda, la intensidad de la luz que difieren según el tipo de célula y necesitan optimización para una clasificación celular eficiente.
Una de las limitaciones de esta técnica subrayadas en los estudios aquí presentados radica en el uso de animales envejecidos y muestras de cerebro post mortem humano debido a las células autofluorescentes. La lipofuscina, es decir, un residuo de la digestión lisosomal, es fluorescente y se acumula en las neuronas envejecidas, la microglía y los astrocitos. FACS puede, con una optimización previa, distinguir las células autofluorescentes de las marcadas positivamente, lo cual es un paso esencial si se estudian animales más viejos. Otra limitación de la técnica es la imposibilidad de comparar directamente la concentración de radiotrazadores entre los diferentes tipos de células clasificadas en diferentes animales. Esto podría realizarse si se considerara la concentración de los radiotrazadores no metabolizados y no unidos a proteínas en la sangre para la normalización en animales.
Una limitación final es la necesidad de que todo el equipo utilizado, por ejemplo, ciclotrón, cámara PET / SPECT, FACS y contador de γ, esté muy cerca físicamente entre sí, especialmente si se utilizan isótopos de vida media corta para imágenes in vivo y FACS-RTT.
FACS-RTT también podría utilizarse como un enfoque independiente, es decir, no necesariamente después de un estudio de imágenes nucleares in vivo 15. La complejidad de la enfermedad cerebral requiere estudiar los mecanismos a nivel celular o a escala unicelular. FACS-RTT podría ser una herramienta traslacional que une los enfoques de imágenes in vivo con un amplio espectro de enfoques de biología celular y molecular ex vivo o in vitro.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subvención nº 320030-184713). Los autores BBT y KC cuentan con el apoyo de la Fundación Velux (proyecto n. 1123). El autor ST recibió el apoyo de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fundación Prof. Dr. Max Cloetta (beca Clinical Medicine Plus) y la Fundación Jean y Madeleine Vachoux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
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