Summary
يعد النسيج المعالج بالفلور المنشط للخلايا المشعة (FACS-RTT) أداة قوية لدراسة دور بروتين نقل 18 kDa أو تعبير مستقبلات السيروتونين 5HT 2A في مرض الزهايمر على نطاقخلوي. يصف هذا البروتوكول التطبيق السابق للجسم الحي ل FACS-RTT في نموذج الفئران TgF344-AD.
Abstract
من المحتمل أن يكون للخلايا الدبقية تأثير كبير في الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر (AD). ربما ترتبط تعديلاتها بحالة مؤيدة للالتهابات. تم تصميم سلالة الفئران TgF344-AD للتعبير عن جينات APP البشرية و PS1ΔE9 البشرية ، وترميز بروتينات الأميلويد Aβ-40 و Aβ-42 ويعرض أمراض الأميلويد والعجز المعرفي مع الشيخوخة. يستخدم نموذج الفئران TgF344-AD في هذه الدراسة لتقييم الأصل الخلوي لبروتين نقل 18 kDa (TSPO ، وهو علامة على تنشيط الخلايا الدبقية) ، ومستويات مستقبلات السيروتونين 5HT 2A (5HT2A R) التي قد تتعطل فيAD. التقنية المعروضة هنا هي فرز الخلايا المنشط بالفلور إلى الأنسجة المعالجة بالليغاند الإشعاعي (FACS-RTT) ، وهي تقنية كمية خاصة بنوع الخلية مكملة لتقنيات التصوير الشعاعي الذاتي في الجسم الحي أو SPECT أو خارج الجسم الحي / في المختبر. وهو يحدد كميا نفس المقتفي المشع المستخدم سابقا للتصوير ، باستخدام عداد γ بعد فرز خلايا قياس الخلايا. هذا يسمح بتحديد الأصل الخلوي للبروتين الموسوم إشعاعيا مع خصوصية وحساسية خلوية عالية. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات التي أجريت على FACS-RTT أن (i) الزيادة في ارتباط TSPO ارتبطت بالخلايا الدبقية الصغيرة في نموذج الفئران من التهاب الأعصاب الناجم عن عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، (ii) ارتبطت الزيادة في ارتباط TSPO في 12 و 18 شهرا بالخلايا النجمية أولا ، ثم الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران TgF344-AD مقارنة بالفئران من النوع البري (WT) ، و (iii) الكثافة المخططة ل 5HT2A R ينخفض في الخلايا النجمية في 18 شهرا في نفس نموذج AD الفئران. ومن المثير للاهتمام ، يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل جميع أجهزة التتبع الإشعاعي تقريبا.
Introduction
تتميز الأمراض العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر (AD) ، بفقدان الخلايا العصبية المرتبطة بزيادة الأعراض. مرض الزهايمر ، السبب الأكثر شيوعا للخرف ، وهو ما يمثل 60٪ -70٪ من الحالات ، يؤثر على حوالي 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. على المستوى العصبي المرضي ، فإن الخاصيتين الرئيسيتين ل AD هما تراكم لويحات β أميلويد خارج الخلية (Aβ) وتشابك تاو العصبي الليفي داخل الخلايا. كما ارتبطت تغيرات الخلايا الدبقية ب AD2 واحتمال تعطيل العديد من أنظمة الناقلات العصبية 3,4.
تم تعديل خط الفئران TgF344-AD إلى نموذج AD من خلال التعبير عن الجينات المحورة البشرية APP و PS1ΔE9 ، مما يؤدي إلى تعبير Aβ-40 و Aβ-42 القابل للذوبان وغير القابل للذوبان وتكوين لوحة الأميلويد5. كما أنه يعرض تراكم أشكال فرط الفوسفوريلات من بروتين تاو مما يؤدي إلى اعتلال تاووباثي. من سن 9-24 شهرا ، تطور الفئران تدريجيا السمات المميزة المرضية لمرض الزهايمر وضعف إدراكي5،6،7،8،9.
التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) ، والتصوير المقطعي المحوسب بالإصدار أحادي الفوتون (SPECT) ، والتصوير الشعاعي الذاتي هي تقنيات تعتمد على انبعاث الأشعة γ وتحديدها كميا. يتم تحديد كميا المقتفيات الإشعاعية إما في الجسم الحي (PET و SPECT) أو خارج الجسم الحي / في المختبر (التصوير الشعاعي الذاتي). وقد ساهمت هذه التقنيات الحساسة في فهم آليات العديد من أمراض الدماغ، مثل مرض الزهايمر. في الواقع ، من حيث الالتهاب العصبي ، هناك الكثير من الدراسات التي تقيم 18 kDa Translocator Protein (TSPO) ، وهي علامة التهاب عصبي في الجسم الحي ، مع مقتفيات ذات علامات إشعاعية مثل [11 C]-(R)-PK11195 أو [11C]PBR28 (للمراجعة انظر 10). بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة تعديلات أنظمة الناقلات العصبية باستخدام المقتفيات الإشعاعية11،12،13.
غير أن هذه التقنيات لا تحدد المنشأ الخلوي للإشارة المشعة. وهذا يمكن أن يعوق تفسير الأسس البيولوجية للتغيير في ربط الرباط المشع في PET/SPECT. على سبيل المثال ، في حالة دراسات TSPO للالتهاب العصبي ، فإن فهم ما إذا كانت زيادة أو نقصان TSPO ناتجة عن التغيرات النجمية أو الدبقية الدقيقة له أهمية قصوى. تم تطوير تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلور إلى الأنسجة المعالجة بالليغاند المشع (FACS-RTT) للتغلب على هذه المشاكل ، مما يسمح بتقييم ربط الرباط الإشعاعي في كل نوع من أنواع الخلايا على حدة وتحديد كثافة البروتين المستهدف لكل خلية. وبالتالي فإن هذه التقنية المبتكرة مكملة ومتوافقة للغاية مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني والتصوير التصويري بالأشعة تحت الحمراء.
هنا ، تم تطبيق هذه التقنية على طول محورين: دراسة التهاب الأعصاب باستخدام الرباط الإشعاعي الخاص ب TSPO وتقييم نظام السيروتونين. في المحور الأول ، كان الهدف هو فهم الأصل الخلوي لإشارة TSPO استجابة لتفاعل التهابي حاد. لذلك ، تم استخدام FACS-RTT على أنسجة المخ للفئران بعد تحريض الالتهاب العصبي عن طريق حقن عديد السكاريد الشحمي (LPS) وبعد دراسة تصوير في الجسم الحي [125I] Clinde Spect. علاوة على ذلك ، تم تطبيق نفس بروتوكول التصوير و FACS-RTT على الفئران TgF344-AD التي يبلغ عمرها 12 و 24 شهرا والفئران المطابقة من النوع البري (WT). يهدف المحور الثاني إلى تحديد أصل تعديلات نظام السيروتونين في نموذج الفئران هذا عن طريق تقييم كثافة الجسم الحي 5-HT2AR حسب نوع الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع لجنة أخلاقيات التجارب البشرية والحيوانية في كانتون جنيف، ولجنة الكانتون لأخلاقيات البحوث، والإدارة العامة للصحة في كانتون جنيف (سويسرا)، على التوالي. يتم الإبلاغ عن البيانات وفقا لإرشادات البحوث الحيوانية: الإبلاغ عن التجارب داخل الجسم الحي (ARRIVE).
1. إعداد كاميرا SPECT ومعايرتها
- قم بتشغيل الكاميرا ، وقم بتحميل برنامج التشغيل (انظر جدول المواد). انقر فوق الزر Home XYZ Stage لأداء التوجيه الموجه.
- قم بإعداد التجربة المكونة من اكتساب مسح ضوئي واحد لمدة 10 دقائق. اضبط وضع الخطوة على Fine ووضع الاكتساب على Listmode (لتسجيل طيف الانبعاثات بأكمله).
- قم بإعداد السرير وتأكد من أن نظام الاحترار ومستشعر التنفس والتخدير وظيفية وآمنة (الشكل 1A-D). ثم ، ضع شبحا (أي 2 مل من تركيز معروف قدره 125I في أنبوب microfuge سعة 2 مل) حيث سيتم وضع رأس الحيوان (يتمركز في المنطقة ، الشكل 1E).
- اضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تحريك المؤشرات للأبعاد الثلاثة بمساعدة الصور الثلاث في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من أن حجم المسح الضوئي للشبح والحيوان هو نفسه.
- ابدأ الفحص الوهمي للمعايرة اللاحقة باستخدام المعلمات المحددة في الخطوات 1.2-1.4.
2. إعداد مساحة العمل لتصوير SPECT
- نظف مساحة العمل باستخدام فيروسيد مطهر وضع أوراق ناعمة على جميع الأسطح.
- تأكد من وجود ما يكفي من الأيسوفلوران والأكسجين في خزاناتهم.
- قم بإعداد قسطرة 24 جم عن طريق قطع زعانف قسطرة الفراشة للحصول على رؤية أوضح لوريد ذيل الفئران.
- قم بتغطية القسطرة عن طريق ملئها بالكامل بمحلول الهيبارين (25000 U / mL) بعد إزالة الإبرة. ثم ضع الإبرة مرة أخرى فيها لتجنب تكوين جلطة دموية بعد إدخال القسطرة.
3. [125I] تخليق المقتفي الإشعاعي CLINDE
تحذير: يمكن أن يكون للنشاط الإشعاعي طاقة مؤينة كافية للتأثير على ذرات الخلايا الحية وإتلاف مادتها الوراثية (DNA).
- ضمان العمل في بيئة مناسبة ، مصرح بها للتجارب التي تنطوي على نشاط إشعاعي.
ملاحظة: ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، للتعامل مع النشاط الإشعاعي، بما في ذلك أجهزة قياس الجرعات بالأصابع والجسم. حاول البقاء على مسافة آمنة من أي مصدر للنشاط الإشعاعي. - احتضان 100 ميكروغرام من سلائف تريبوتيلين في 100 ميكرولتر من حمض الخليك مع يوديد الصوديوم (Na125I) (انظر جدول المواد) و 5 ميكرولتر من حمض البيراسيتيك 37٪ عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز تدوير حراري يوضع في صندوق قفازات.
- قم بتخفيف التفاعل باستخدام 50٪ من الأسيتونيتريل (ACN) في الماء للوصول إلى حجم 500 ميكرولتر. حقن 500 ميكرولتر من التفاعل المخفف في عمود الطور العكسي (انظر جدول المواد).
- اعزل [125I] CLINDE باستخدام HPLC متدرج خطي يعمل من 5٪ -95٪ ACN في 7 mM H3PO4 لمدة 10 دقائق. قم بتخفيف العزل في H2O للوصول إلى حجم نهائي قدره 10 مل ، ثم حقن التفاعل المخفف في عمود تركيز (انظر جدول المواد).
- قم بإخراج [125I] CLINDE من العمود مع 300 ميكرولتر من الإيثانول المطلق ، ثم تبخر الإيثانول عن طريق احتضانه في جهاز طرد مركزي فراغي في RT لمدة 40 دقيقة.
- قم بتخفيف البقايا التي تحتوي على [125I] CLINDE في 300 ميكرولتر من محلول ملحي معقم لإنشاء محلول مخزون.
- بعد قياس نشاطه الإشعاعي ، قم بتخفيف محلول المخزون في محلول ملحي معقم للحصول على محلول 0.037 ميجا بايت في 500 ميكرولتر.
- تنقية المقتفي بواسطة HPLC (كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء). حدد وقت الاستخلاص باستخدام معايرة قياسية عند 450 نانومتر، واعزل الذروة المشعة المفردة. قم بإجراء منحنى المعايرة القياسي باستخدام سبعة تركيزات قياسية من CLINDE البارد (غير المشع ) (0.1 ميكروغرام ، 0.5 ميكروغرام ، 0.75 ميكروغرام ، 1 ميكروغرام ، 1.5 ميكروغرام ، 2 ميكروغرام ، و 5 ميكروغرام في 400 ميكرولتر من محلول 50٪ ACN). حدد النقاء الكيميائي الإشعاعي عن طريق قياس ذروة واحدة في TLC الراديوي (كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة). تأكد من أن نقاء المادة الكيميائية الإشعاعية أعلى من 60٪.
- تحقق من النشاط المحدد للرباط الإشعاعي الذي يقيس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 450 نانومتر ومنحنيات المعايرة المنشأة باستخدام المركبات المرجعية الباردة. تأكد من أن النشاط المحدد أكبر من 1000 جيجابايت/ميكرومول.
4. [125I]R91150 تركيب المقتفي الإشعاعي
ملاحظة: تأكد من اتباع نفس قواعد الأمان المذكورة في قسم تجميع CLIND.
- امزج 300 ميكروغرام من سلائف R91150 في محلول من 3 ميكرولتر من الإيثانول المطلق ، و 3 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي ، و 15 ميكرولتر من Na125I الخالي من الناقل (انظر جدول المواد) (10 mCi) في 0.05 M NaOH و 3 ميكرولتر من 30٪ H 2 O2. احتضان لمدة 30 دقيقة في صندوق القفازات.
- حقن التفاعل بأكمله في عمود الطور العكسي (انظر جدول المواد).
- عزل [125I]R91150 بواسطة تشغيل HPLC متساوي الأضلاع (ACN / water 50/50 ، مخزن مؤقت لحمض الخليك 10 mM) بمعدل تدفق 3 مل / دقيقة.
- تمييع [125I]R91150 في H2O للحصول على حجم نهائي قدره 10 مل.
- حقن 10 مل من التفاعل المخفف في عمود تركيز (انظر جدول المواد).
- Elute [125I]R91150 من العمود مع 300 ميكرولتر من الإيثانول المطلق.
- تبخر الإيثانول عن طريق احتضانه في جهاز طرد مركزي فراغي في RT لمدة 40 دقيقة.
- تمييع البقايا التي تحتوي على [125I]R91150 في 300 ميكرولتر من المياه المالحة.
- تنقية المقتفي بواسطة HPLC. حدد وقت الاستخلاص باستخدام معايرة قياسية عند 450 نانومتر واعزل الذروة المشعة المفردة. حدد النقاء الكيميائي الإشعاعي عن طريق قياس ذروة واحدة في TLC الراديوي. تأكد من أن نقاء المادة الكيميائية الإشعاعية أعلى من 98٪.
5. إعداد الحيوانات
- وزن وتخدير الفئران TgF344-AD (ذكر أو أنثى ، من 2-24 شهرا من العمر) في غرفة تحريض مع 3 ٪ isoflurane. بمجرد تخديره بعمق ، اخفض تدفق الأيزوفلوران إلى 2٪ (0.4 لتر / دقيقة ، 100٪ O2) في الغرفة.
- ضع الحيوان على سرير تم تسخينه مسبقا ومجهز بتخدير مخروط الأنف. الحفاظ على الايزوفلوران في 2٪ (0.4 لتر / دقيقة ، 100٪ O2).
- تطبيق زيوت تشحيم هلام العين في عيون الحيوان وتأكيد عمق التخدير عن طريق مراقبة الجهاز التنفسي. ضبط التخدير إذا لزم الأمر.
- قم بإجراء إدخال قسطرة 24 G في الوريد الذيلي.
6. اقتناء الطيف
- انقل الحيوان إلى سرير الكاميرا المجهز بوسادة تدفئة يتم التحكم في درجة حرارتها على 38 درجة مئوية (الشكل 1E).
- قم بتأمين رأس الحيوان على شريط العضة وقم بإصلاح دعامات الرأس.
- قم بإعداد التجربة على مسح ضوئي مدته 60 دقيقة يتكون من 60 إطارا لمدة 1 دقيقة. إعادة استخدام كافة المعلمات الأخرى التي تم إعدادها في الخطوة 1. انقر فوق الزر " تحديث الصورة" لتحديث موضع الحيوان.
- اضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تحريك المؤشرات بمساعدة الصور الثلاث في الجزء السفلي من الشاشة للأبعاد الثلاثة.
- حقن 500 ميكرولتر من المقتفي الإشعاعي المشع ([125 I]CLINDE أو [125I]R91150) ، ثم اغسل الأنبوب ب 300 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪. انقر في وقت واحد على بدء الاستحواذ لبدء الفحص.
- خلال وقت الفحص ، تأكد من الحفاظ على الحيوان تحت التخدير المستمر مع مراقبة معدل التنفس. اضبط تدفق الأيزوفلوران إذا لزم الأمر.
- بمجرد انتهاء الفحص ، قم بالقتل الرحيم بسرعة للحيوان المخدر عن طريق قطع الرأس.
7. إعادة بناء المسح الضوئي
- افتح برنامج إعادة بناء المسح الضوئي (راجع جدول المواد)، ثم افتح مجموعة البيانات، بحثا عن ملف [filename].parameters الذي تم إنشاؤه في مجلد الفحص.
- حدد النظير محل الاهتمام. لاحظ أن معلمة Listmode تسمح باختيار نظائر متعددة في هذه الخطوة.
- حدد المعلمات التالية: حجم Voxel 0.4 مم ، و 4 مجموعات فرعية (POS-EM) ، و 6 تكرارات (مكافئ 24ME-EM) ، ولا يوجد مرشح لاحق ، وتصحيح الاضمحلال المقابل للنظير. حدد تنسيق الإخراج إلى NIfTI، ثم حدد بدء إعادة إنشاء SPECT .
8. استخراج دماغ الفئران
- في نفس حدث التخدير مثل إجراء المسح وبعد التأكد من حالة التخدير العميق للحيوان من خلال مراقبة معدل التنفس ، انتقل إلى قطع الرأس بالمقصلة ونقل الرأس بسرعة إلى مقعد التشريح.
- باستخدام المقص ، قم بقطع الجلد بعناية أعلى الرأس من الخلف إلى الأمام حتى منتصف العينين.
- قطع العضلات الزائدة حول قاعدة الجمجمة والفقرات العنقية.
- بعد ذلك ، ضع بعناية شفرة واحدة من المقص في الحفرة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة ، الثقبة العظمية ، وقم بإزالة الجزء الخلفي من الجمجمة بكماشة جراحية.
- ثم ، مع كماشة جراحية ، قم بإزالة الجزء العلوي من الجمجمة بعناية. يمكن أن تكون جمجمة الفئران الذكور القديمة سميكة ، وإزالتها كقطع صغيرة لتجنب تلف الدماغ.
- قطع بعناية السحايا مع مقص. السحايا يمكن أن تلحق الضرر بالدماغ أثناء عملية الاستخراج. إزالته كإجراء احترازي.
- بعد إزالة الجزء العلوي من الجمجمة ، أدر رأس الحيوان ، وباستخدام ملعقة مسطحة صغيرة ، اسحب الدماغ بعناية عن طريق قطع الأعصاب البصرية والثلاثية التوائم.
- انقل الدماغ بعناية إلى سطح زجاجي مسطح ونظيف للتشريح على الجليد.
- استخدم ملعقة معدنية مسطحة وشفرة حلاقة لتشريح المناطق التي تهم الدماغ. ضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي 2 مل وقم بوزن الأنسجة التي تم الحصول عليها. استخدم قسم الدماغ مباشرة لعزل الخلايا أو قم بتجميده بسرعة في النيتروجين السائل للاستخدام لاحقا.
9. عزل الخلايا
- تأكد من العمل في بيئة نظيفة ومعقمة. ينصح بالعمل تحت خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية (BSC). تأكد من أن القفازات وكل قطعة من المعدات التي يتم إدخالها في BSC معقمة.
- لإعداد الخلايا لفرز الخلايا ، اتبع البروتوكول من Jaclyn M. Schwarz14.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم استخدام مجموعة أدوات التفكك العصبي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) لإعداد الخلايا.- ضع العينات في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل مع 1 مل من HBSS (خال من الكالسيوم و Mg) ، ثم جهاز طرد مركزي (300 × g ، 2 min ، درجة حرارة الغرفة = RT) وقم بإزالة supernatant دون إزعاج الكرية.
- أضف 1900 ميكرولتر من إنزيم mix-1 واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء تحريك الأنابيب عن طريق الانعكاس كل 5 دقائق.
- أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 ، وحرك بلطف باستخدام الماصة 1 (انظر جدول المواد) ذهابا وإيابا 30 مرة. ثم ، احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء تحريك الأنابيب عن طريق الانعكاس كل 5 دقائق.
- اخلطي بلطف ذهابا وإيابا مع ماصة 2 ، ثم ماصة 3 قبل الحضانة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الأنسجة.
- قم بتصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلايا 80 ميكرومتر ، وأضف 10 مل من HBSS (خالية من الكالسيوم و Mg). جهاز طرد مركزي (300 × جم ، 10 دقائق ، RT) وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية.
- لاستنفاد المايلين ، أعد تعليق الكريات مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين (انظر جدول المواد) ، ثم أضف 100 ميكرولتر من حبات إزالة المايلين (انظر جدول المواد) ، قبل الحضانة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- أضف 5 مل من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ، وأجهزة الطرد المركزي (300 × جم ، 10 دقائق ، RT) ، وقم بإزالة supernatant دون إزعاج الكرية.
- أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وضع الأنبوب في عمود المجال المغناطيسي. اغسل العمود ب 1 مل من المخزن المؤقت لإزالة المايلين أربع مرات.
- جهاز طرد مركزي (300 × جم ، 2 دقيقة ، RT) وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. دوامة لفترة وجيزة (2 ثانية) لفصل الخلايا وإضافة 5 ميكرولتر من كتلة Fc CD32. دوامة مرة أخرى وحضانة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية ؛ تحضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- جهاز طرد مركزي (350 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية) وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. لطخة الأنابيب رأسا على عقب على ورق ناعم.
- بعد دوامة قصيرة (2 ثانية) ، أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوي واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- أضف 2 مل من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ، وأجهزة الطرد المركزي (350 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية) وقم بإزالة supernatant دون إزعاج الكريات. لطخة الأنابيب رأسا على عقب على ورق ناعم. أعد تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من PBS المعقمة وانتقل مباشرة إلى فرز الخلايا.
10. فرز الخلايا
- قم بإعداد أنبوب microfuge مع 500 ميكرولتر من PBS المعقمة لجمع الخلايا المفروزة.
- أضف 10 ميكرولتر من Hoechst لكل 1000 ميكرولتر من محلول الخلية لتلوين نوى الخلايا الحية وتمييزها عن الخلايا الميتة.
- انقل الخلايا في أقرب وقت ممكن إلى آلة فرز الخلايا عند 4 درجات مئوية.
- أولا ، فرز الخلايا حسب التشتت الأمامي والجانبي ، ثم فرز الخلايا الإيجابية Hoechst. بعد ذلك ، قم بفرز الخلايا بناء على الأجسام المضادة ذات الاهتمام. جمع الخلايا الملطخة بشكل إيجابي بشكل منفصل. تأكد من التمييز بين الخلايا الإيجابية والخلايا ذاتية الفلورسنت.
- احسب عدد الخلايا التي تم فرزها لكل تجمع اهتمامات.
11. عد غاما
- قم بمعايرة نظام العد γ باستخدام 10 ميكرولتر من نفس المحلول الوهمي المستخدم في معايرة SPECT ولكن قم بتخفيفه في 1 مل من الماء.
ملاحظة: يتم تخفيف المحلول الوهمي بسبب الدقة المحسنة لنظام عد γ. - ضع أنبوب الخلايا التي تم فرزها في نظام العد γ وتابع عد γ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفئران WT من ذوي الخبرة في الجسم الحي SPECT المسح الضوئي مع [125I]CLINDE المقتفي الإشعاعي بعد حقن LPS من جانب واحد (الشكل 2). أظهر هذا المسح الضوئي (باستخدام بيانات مجمعة من صور 45-60 دقيقة بعد حقن التتبع الإشعاعي) ارتباطا أعلى ل [125I]CLINDE في موقع حقن LPS (الشكل 2A) مقارنة بالمنطقة المقابلة من الدماغ (الشكل 2B). أكدت العينات خارج الجسم الحي التي خضعت ل FACS-RTT تلك النتائج وكشفت عن وجود عدد أكبر من مواقع ربط [125 I] CLINDE فقط في الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يدل على أن الأصل الخلوي لإشارة [125I] CLINDE في الجانب الجانبي من الدماغ كان دبقية صغيرة (الشكل 3A)15.
باستخدام نفس المقتفي الإشعاعي [125I] CLINDE ، تم إجراء البروتوكول بعد ذلك على الحصين للفئران القديمة TgF344-AD (12 و 24 شهرا) ومقارنتها ب WT البالغ من العمر 24 شهرا. أظهرت النتائج أن الزيادة في ربط TSPO في 12 شهرا في الفئران TgF344-AD كانت مقتصرة على الخلايا النجمية. في الفئران التي يبلغ عمرها 24 شهرا ، كانت الزيادة في ربط TSPO ناتجة عن كل من التغيرات النجمية والدبقية الدقيقة (الشكل 3B). أظهرت النتائج أن التعبير المفرط TSPO في الخلايا النجمية ربما لوحظ قبل الخلايا الدبقية الصغيرة. بشكل مستقل ، باستخدام المقتفي الإشعاعي [125I] R91150 ، تم استخدام هذه التقنية على نطاق خلوي لإظهار أنه في الفئران TgF344-AD القديمة ، أظهرت الخلايا النجمية المخططة كثافة منخفضة 5HT2AR عند مقارنتها ب WT (الشكل 3C)16.
وأخيرا ، تم إجراء FACS-RTT على عينات ما بعد الوفاة البشرية AD. بعد الانفصال ، تم احتضان الخلايا ب [125I] CLINDE قبل التلطيخ وإجراء FACS. سمح ذلك باكتشاف فرط التعبير القشري ل TSPO في كل من الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة لموضوعات AD مقارنة بعناصر التحكم المتطابقة مع العمر (الشكل 3D).
الشكل 1: إعداد كاميرا SPECT . (أ) العرض العام لكاميرا SPECT. (ب) عرض السرير مع مراقبة السخان ومعدل التنفس. (ج) سدادات أنبوب التخدير. (د) سرير التدفئة ومقبس مسبار الجهاز التنفسي. (ه) عرض مراقبة المواقع الوهمية من البرنامج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير الدماغ TSPO باستخدام SPECT مع [125I] CLINDE المقتفي الإشعاعي. صور تمثيلية (45-60 دقيقة بعد حقن [125I]CLINDE) للحصين بعد (A) LPS أو (B) حقن ملحي في الجانب الجانبي (الأبيض) والمقابل (الأحمر) من الدماغ. في الجسم الحي ، يتم تمثيل منحنيات النشاط الزمني المقاسة بحجم الاهتمام في اللوحة اليمنى. SPECT: التصوير المقطعي المحوسب بإصدار فوتون واحد. TSPO: بروتين المحول. LPS: عديد السكاريد الشحمي. n = 7 لكل شرط. وقد عدل هذا الرقم من Tournier et al.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس الكمي ل TSPO و 5HT2AR. (A) الأصل الخلوي للإفراط في التعبير عن TSPO بعد حقن الدماغ من جانب واحد من LPS. تم قياس النشاط الإشعاعي (٪ جرعة حقن / غرام من الأنسجة) في كل مجموعة من الخلايا في الجانب المقابل (الرمادي ، n = 7) والجانب الجانبي (الأخضر ، n = 7) من الحقن. الاختبار الإحصائي المستخدم: اختبار t المقترن. (ب) TSPO في الفئران القديمة TgF344-AD. تم تحديد تركيزات [125I] CLINDE (٪ جرعة حقن / غرام من الأنسجة) في الحيوانات البرية من النوع البري البالغة من العمر 24 شهرا (الرمادي ، n = 9) وفي 12- (الأخضر ، n = 8) و 24 شهرا (الأرجواني ، n = 7) TgF344- AD الفئران. الاختبار الإحصائي المستخدم: ANOVA ثنائي الاتجاه. (C) ينخفض 5HT2AR في الخلايا النجمية للمخطط في الفئران القديمة TgF344-AD. تم تحديد تركيز [125I]R91150 في الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة على المستوى الخلوي (٪ جرعة / خلية حقن) في WT (رمادي ، n = 7) و TgF344-AD القديم (أخضر ، n = 11) الفئران. الاختبار الإحصائي المستخدم: ANOVA أحادي الاتجاه. (د) مصدر الخلية للتعبير المفرط TSPO في القشرة الأمامية في مرض الزهايمر (AD). في كل مجموعة خلوية ، يتم قياس النشاط الإشعاعي (٪ جرعة حقن / غرام من الأنسجة) في مواضيع AD (الأخضر ، n = 9) والتحكم (الرمادي ، n = 9). الاختبار الإحصائي المستخدم: اختبار t غير المقترن. يتم تمثيل جميع البيانات كمتوسط ± 95٪ CI مع التعليق التوضيحي التالي: * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، *** p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على حد علمنا ، كانت هذه التقنية هي الأولى التي تصف نهجا يسمح بفهم أفضل لتعديلات الربط في الجسم الحي للمقتفي الإشعاعي على المستوى الخلوي. يصف البروتوكول طريقة متعددة المقاييس لقياس ارتباط المقتفي الإشعاعي على المستوى الخلوي باستخدام [125 I] CLINDE (TSPO) أو [125I]R91150 (5HT2AR) كأمثلة.
هذه التقنية قوية وحساسة بما يكفي للكشف بدقة عن الأصل الخلوي لمجموعة واسعة من تغيرات الخلايا الدبقية التي تتراوح من تفاعل التهابي مكثف يسببه LPS إلى تغيرات الخلايا الدبقية الأكثر دقة التي لوحظت في نموذج الفئران من AD ، مما يجلب معلومات تكميلية مهمة إلى التصوير العصبي النووي في الجسم الحي ، مثل الأصل الدبقي الصغير للإشارة التي تم الحصول عليها باستخدام SPECT التي تم تحديدها. أظهرت الدراسة كذلك أن FACS-RTT كان قادرا على تمييز تغيرات كثافة المستقبلات العصبية على المستوى الخلوي مع مثال 5HT2AR (الشكل 3C). وأخيرا، تم تقديم أدلة على استخدام هذه التقنية في أنسجة الإنسان بعد الوفاة، مما يدل على زيادة تركيز TSPO في الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة لموضوعات مرض الزهايمر.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تكاملها مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني وتصوير SPECT. في الواقع ، التصوير النووي هو تقنية قوية يمكنها استخراج المعلومات من منطقة الدماغ أو مستوى فوكسل. ومع ذلك ، فإن حده يكمن في النطاق الخلوي. من المستحيل التمييز بين مساهمة كل نوع خلية في الإشارة. يسمح FACS-RTT بالذهاب إلى أبعد من ذلك من خلال الكشف عن تركيز المقتفي الإشعاعي في كل نوع من أنواع الخلايا. ومن المثير للاهتمام، من الناحية النظرية، أنه يمكن تقييم مجموعة غير محدودة من الأهداف باستخدام هذه التقنية، ويتمثل القيد في توافر جهاز تتبع إشعاعي للهدف محل الاهتمام.
وتشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول استخدام النشاط الإشعاعي الذي يجب القيام به في بيئة آمنة مع موظفين مؤهلين. وعلاوة على ذلك، من الأهمية بمكان النظر في الاضمحلال الإشعاعي. لإعداد FACS ، يجب على المرء ضمان خصوصية الأجسام المضادة والطول الموجي وشدة الضوء التي تختلف اعتمادا على نوع الخلية وتحتاج إلى تحسين لفرز الخلايا بكفاءة.
يكمن أحد قيود هذه التقنية التي تم التأكيد عليها في الدراسات المقدمة هنا في استخدام الحيوانات المسنة وعينات الدماغ البشرية بعد الوفاة بسبب خلايا الفلورسنت الذاتي. ليبوفوسين ، أي بقايا هضم الليزوزومات ، هو فلورسنت ويتراكم في الخلايا العصبية المتقدمة في السن ، والخلايا الدبقية الصغيرة ، والخلايا النجمية. يمكن ل FACS ، مع التحسين المسبق ، التمييز بين الخلايا الفلورية الذاتية والخلايا ذات العلامات الإيجابية ، وهي خطوة أساسية إذا تمت دراسة الحيوانات الأكبر سنا. هناك قيد آخر لهذه التقنية وهو استحالة المقارنة المباشرة لتركيز المقتفي الإشعاعي بين أنواع الخلايا المختلفة التي تم فرزها عبر الحيوانات المختلفة. يمكن إجراء ذلك إذا تم النظر في تركيز المقتفيات الإشعاعية غير المستقلبة وغير المرتبطة بالبروتين في الدم للتطبيع عبر الحيوانات.
ويتمثل أحد القيود الأخيرة في الحاجة إلى أن تكون جميع المعدات المستخدمة، مثل السيكلوترون، وكاميرا PET/SPECT، وFACS، وعداد γ، على مقربة مادية من بعضها البعض، خاصة إذا استخدمت نظائر نصف العمر القصيرة للتصوير في الجسم الحي وFACS-RTT.
ويمكن أيضا استخدام FACS-RTT كنهج قائم بذاته، أي ليس بالضرورة اتباع دراسة التصوير النووي في الجسم الحي 15. يتطلب تعقيد أمراض الدماغ دراسة الآليات على المستوى الخلوي أو على نطاق خلية واحدة. يمكن أن يكون FACS-RTT أداة انتقالية تربط بين نهج التصوير الحي مع مجموعة واسعة من نهج البيولوجيا الخلوية والجزيئية خارج الجسم الحي أو في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنحة رقم 320030-184713). يتم دعم المؤلفين BBT و KC من قبل مؤسسة Velux (المشروع رقم 1123). تلقى المؤلف ST الدعم من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة التنقل المبكرة بعد الدكتوراه ، لا. P2GEP3_191446) ، ومؤسسة البروفيسور الدكتور ماكس كلويتا (منحة الطب السريري بلس) ، ومؤسسة جان ومادلين فاتشو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
