Fluorescensaktiverad cellsortering-radioligandbehandlad vävnad (FACS-RTT) är ett kraftfullt verktyg för att studera rollen av 18 kDa-translokatorproteinet eller Serotonin 5HT2A-receptoruttrycket vid Alzheimers sjukdom i cellulär skala. Detta protokoll beskriver ex-vivo-appliceringen av FACS-RTT i TgF344-AD-råttmodellen.
Glialceller har förmodligen en betydande implikation i patofysiologin för neurodegenerativa störningar, såsom Alzheimers sjukdom (AD). Deras förändringar är kanske förknippade med ett proinflammatoriskt tillstånd. TgF344-AD-råttstammen har utformats för att uttrycka humana APP- och humana PS1ΔE9-gener , som kodar för amyloidproteiner Aβ-40 och Aβ-42 och visar amyloidpatologi och kognitiva underskott med åldrande. TgF344-AD-råttmodellen används i denna studie för att utvärdera det cellulära ursprunget för 18 kDa-translokatorproteinet (TSPO, en markör för gliacellaktivering) bindning och 5HT2A-receptorn (5HT2AR) serotoninreceptornivåerna som eventuellt störs i AD. Tekniken som presenteras här är Fluorescensaktiverad cellsortering till radioligandbehandlad vävnad (FACS-RTT), en kvantitativ celltypspecifik teknik som kompletterar in vivo PET eller SPECT eller ex vivo / in vitro autoradiografi tekniker. Den kvantifierar samma radiomärkta spårämne som användes tidigare för avbildning, med hjälp av en γ räknare efter cellsortering av cytometri. Detta gör det möjligt att bestämma det cellulära ursprunget för det radiomärkta proteinet med hög cellulär specificitet och känslighet. Till exempel visade studier med FACS-RTT att (i) ökningen av TSPO-bindning var associerad med mikroglia i en råttmodell av lipopolysackarid (LPS) -inducerad neuroinflammation, (ii) en ökning av TSPO-bindning vid 12- och 18 månader var associerad med astrocyter först och sedan mikroglia hos TgF344-AD-råttor jämfört med vilda typ (WT) råttor, och (iii) striataldensiteten hos 5HT2A R minskar i astrocyter vid 18 månader i samma råtta AD-modell. Intressant nog kan denna teknik utvidgas till praktiskt taget alla radiotracers.
Neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom (AD), kännetecknas av en neuronal förlust i samband med ökade symtom. AD, den vanligaste orsaken till demens, som står för 60%-70% av fallen, drabbar cirka 50 miljoner människor världen över1. På neuropatologisk nivå är de två huvudsakliga egenskaperna hos AD ackumuleringen av extracellulära amyloid-β (Aβ) plack och intracellulära Tau neurofibrillära trassel. Glialcellsförändringar har också associerats med AD2 och möjlig störning av flera neurotransmittorsystem 3,4.
TgF344-AD-råttlinjen har modifierats till modell AD genom att uttrycka humana APP- och PS1ΔE9-transgener, vilket leder till lösliga och olösliga Aβ-40- och Aβ-42-uttryck och amyloidplackbildning5. Det presenterar också ackumulering av hyperfosforylerade former av Tau-proteinet som leder till tauopati. Från 9-24 månaders ålder utvecklar råttorna gradvis de patologiska kännetecknen för AD och en kognitiv försämring 5,6,7,8,9.
Positronemissionstomografi (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) och autoradiografi är tekniker baserade på emission och kvantifiering av γ strålar. Radiotracers kvantifieras antingen in vivo (PET och SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Dessa känsliga tekniker har bidragit till förståelsen av mekanismer för flera hjärnsjukdomar, såsom AD. När det gäller neuroinflammation finns det faktiskt många studier som bedömer 18 kDa Translocator Protein (TSPO), en in vivo neuroinflammationsmarkör, med radiomärkta spårämnen som [11C] -(R) -PK11195 eller [11C] PBR28 (för granskning se10). Dessutom har förändringar av neurotransmittorsystem studerats med hjälp av radiotracers 11,12,13.
Dessa tekniker bestämmer emellertid inte den radioaktiva signalens cellulära ursprung. Detta skulle kunna hindra tolkningen av den biologiska grunden för ändringen i bindningen av en radioligand i PET/SPECT. Till exempel, när det gäller TSPO-studier av neuroinflammation, är det av största vikt att förstå om ökningen eller minskningen av TSPO beror på astrocytiska eller mikrogliala förändringar. Tekniken Fluorescensaktiverad cellsortering till radioligandbehandlad vävnad (FACS-RTT) utvecklades för att komma runt dessa problem, vilket möjliggjorde bedömning av radioligandbindning i varje celltyp separat och kvantifiering av målproteindensiteten per cell. Denna innovativa teknik är följaktligen kompletterande och mycket kompatibel med PET- och SPECT-avbildning.
Här tillämpades denna teknik längs två axlar: studien av neuroinflammation med användning av TSPO-specifika radioligander och bedömning av det serotonerga systemet. På den första axeln var målet att förstå TSPO-signalens cellulära ursprung som svar på en akut inflammatorisk reaktion. Därför användes FACS-RTT på hjärnvävnaderna hos råttor efter induktion av neuroinflammation via en lipopolysackaridinjektion (LPS) och efter en in vivo [125I] CLINDE SPECT-avbildningsstudie. Vidare tillämpades samma avbildnings- och FACS-RTT-protokoll på 12- och 24 månader gamla TgF344-AD-råttor och matchande vildtypsråttor (WT). Den andra axeln syftade till att bestämma ursprunget till serotoninerga systemförändringar i denna råttmodell via ex vivo 5-HT2AR densitetsbedömning efter celltyp.
Såvitt vi vet var denna teknik den första som beskrev ett tillvägagångssätt som möjliggör en bättre förståelse av in vivo-bindande förändringar av en radiotracer på cellulär nivå. Protokollet beskriver en flerskalig metod för att kvantifiera radiotracerbindning på cellulär nivå med [125I] CLINDE (TSPO) eller [125I] R91150 (5HT2AR) som exempel.
Denna teknik är robust och känslig nog för att exakt detektera det cellulära ursprunget…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (bidrag nr 320030-184713). Författarna BBT och KC stöds av Velux Foundation (projekt n. 1123). Författare ST fick stöd från Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), Prof. Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus-stipendiet) och Jean och Madeleine Vachoux Foundation.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
HPLC | Knauer | ||
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
R91150 précursor | CERMN | ||
Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
Tributylin precursor | CERMN | ||
U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |