Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка-радиолигандная обработанная ткань (FACS-RTT) является мощным инструментом для изучения роли транслокаторного белка 18 кДа или экспрессии серотонина 5HT2A-рецептора при болезни Альцгеймера в клеточном масштабе. Этот протокол описывает применение EX-vivo FACS-RTT в модели крыс TgF344-AD.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка-радиолигандная обработанная ткань (FACS-RTT) для определения клеточного происхождения радиоактивного сигнала
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Глиальные клетки, вероятно, имеют значительное значение в патофизиологии нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (БА). Их изменения, возможно, связаны с провоспалительным состоянием. Штамм крыс TgF344-AD был разработан для экспрессии человеческих генов APP и ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО PS1ΔE9 , кодирующих амилоидные белки Aβ-40 и Aβ-42 и демонстрирующих амилоидную патологию и когнитивный дефицит со старением. Модель крыс TgF344-AD используется в этом исследовании для оценки клеточного происхождения связывания 18 кДа транслокаторного белка (TSPO, маркер активации глиальных клеток) и уровней рецептора серотонина 5HT2A (5HT2AR), которые, возможно, нарушаются при AD. Метод, представленный здесь, представляет собой флуоресцентно-активированную сортировку клеток в радиолигандную обработанную ткань (FACS-RTT), количественный метод, специфичный для типа клеток, дополняющий методы ауторадиографии in vivo PET или SPECT или ex vivo / in vitro . Он количественно определяет тот же радиоактивный индикатор, который использовался ранее для визуализации, используя счетчик γ после сортировки клеток цитометрии. Это позволяет определить клеточное происхождение меченого радиоактивным путем белка с высокой клеточной специфичностью и чувствительностью. Например, исследования с FACS-RTT показали, что (i) увеличение связывания TSPO было связано с микроглией в крысиной модели нейровоспаления, индуцированного липополисахаридом (LPS), (ii) увеличение связывания TSPO через 12 и 18 месяцев было связано сначала с астроцитами, а затем с микроглией у крыс TgF344-AD по сравнению с крысами дикого типа (WT) и (iii) стриатальной плотностью 5HT2A. R снижается в астроцитах через 18 месяцев в той же модели AD крыс. Интересно, что эта техника может быть распространена практически на все радиоиндикаторы.
Введение
Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (БА), характеризуются потерей нейронов, связанной с усилением симптомов. БА, наиболее распространенная причина деменции, на которую приходится 60-70% случаев, затрагивает около 50 миллионов человек во всем мире1. На нейропатологическом уровне двумя основными характеристиками БА являются накопление внеклеточных амилоидно-β (Aβ) бляшек и внутриклеточных тау-нейрофибриллярных клубков. Изменения глиальных клеток также были связаны с AD2 и возможным нарушением работы нескольких нейротрансмиттерных систем 3,4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры проводились по согласованию с Комитетом по этике экспериментов на людях и животных кантона Женева, Кантональной комиссией по этике исследований (CCER) и Общим руководством по охране здоровья кантона Женева (Швейцария), соответственно. Данные сообщаются в соответствии с руководящими принципами исследований на животных: отчетность по экспериментам In vivo (ARRIVE).
1. Подготовка и калибровка камеры ОФЭКТ
- Включите камеру, загрузите операционное программное обеспечение (см. Таблицу материалов). Нажмите на кнопку Home XYZ Stage , чтобы выполнить самонаведение.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Крысы WT испытали in vivo SPECT сканирование с помощью радиоиндикатора [125I]CLINDE после односторонней инъекции LPS (рисунок 2). Это сканирование (с использованием суммированных данных из изображений 45-60 мин после инъекции радиоиндикатора) показало более высокое связывание [125I]CLINDE в месте инъекции LPS (рисунок 2A), чем в контралатеральной области мозга (рисунок 2B). Образцы ex vivo , к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Насколько нам известно, этот метод был первым, который описал подход, который позволяет лучше понять изменения связывания in vivo радиоиндикатора на клеточном уровне. Протокол описывает многомасштабный метод количественной оценки связывания радиоиндикатора на клеточном уровне с использованием [125I]CLINDE (TSPO) или [125I]R91150 (5HT2AR) в качестве примеров.
Этот метод является надежным и достаточно чувствительным, чтобы точно обнаружить клеточное прои.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (грант No 320030-184713). Авторы ББТ и КС поддерживаются Фондом Velux (проект No 1123). Автор ST получил поддержку от Швейцарского национального научного фонда (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Фонд профессора доктора Макса Клоэтты (стипендия Clinical Medicine Plus) и Фонд Жана и Мадлен Вашу.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Уксусная кислота | Sigma-Aldrich | ||
| Ацетонитрил | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet BioVet | Программное обеспечение для проверки жизненно важных функций | ||
| Bondclone C18 реверсивная фазовая колонка | Phenomenex, Шлирен, Швейцария | ||
| Университетская клиника | Де-Сюр | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Реакционная способность для крыс |
| FITC-конъюгированный антикрысиный CD90 | Biolegend | 202504 | Реакционная способность для крыс |
| Гепарин | B. Braun | B01AB01 | |
| ВЭЖХ | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0,75 IN 0,7 x 19 мм | BD Biosciences | 321312 | катетер 24 G |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Колонны | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Микропористая мягкая лента | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Программное обеспечение для камеры SPECT | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Сортировщик клеток | |
| Шарики для удаления миелина II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Содержит гранулы и буфер для удаления миелина. |
| NaCl 0,9% Стерильный раствор | B. Braun | 395202 | |
| Набор для нейронной диссоциации (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Содержит ферментные смеси, пипетки 1, 2 и 3. |
| Нейлоновая сетка Лист | Amazon | CMN-0074-10YD | ширина 40 дюймов, размер ячейки 80 микрон |
| Надуксусная кислота | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 pré курсор | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Колонна | Вода | Концентрационная колонка | |
| Йодид натрия Na125 | PerkinElmer | ||
| Предшественник трибутилина | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Программное обеспечение для реконструкции изображений ОФЭКТ |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Гамма-счетчик |
Ссылки
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
