Synthese und Charakterisierung von mRNA-beladenen Poly(beta-Aminoestern) Nanopartikeln für Impfzwecke
Summary
Hier wird ein einfaches Protokoll zur Herstellung von mRNA-Nanopartikeln auf Basis von Poly(beta-Aminoester)-Polymeren vorgestellt, das einfach durch Änderung der verkapselten mRNA angepasst werden kann. Der Workflow für die Synthese der Polymere, der Nanopartikel und deren in vitro essentielle Charakterisierung werden ebenfalls beschrieben. Ein Proof-of-Concept zur Immunisierung wird ebenfalls hinzugefügt.
Abstract
Die Impfung ist einer der größten Erfolge der modernen Gesellschaft und unverzichtbar bei der Kontrolle und Vorbeugung von Krankheiten. Traditionelle Impfstoffe bestanden aus ganz oder aus Bruchteilen des Infektionserregers. Es bleiben jedoch Herausforderungen bestehen, und neue Impfstofftechnologien sind obligatorisch. In diesem Zusammenhang hat die Verwendung von mRNA zu Immunisierungszwecken eine verbesserte Leistung gezeigt, wie die schnelle Zulassung von zwei mRNA-Impfstoffen zeigt, die eine SARS-CoV-2-Infektion verhindern. Neben dem Erfolg bei der Prävention von Virusinfektionen können mRNA-Impfstoffe auch für therapeutische Krebsanwendungen eingesetzt werden.
Dennoch macht die Instabilität der mRNA und ihre schnelle Clearance aus dem Körper aufgrund der Anwesenheit von Nukleasen ihre nackte Abgabe nicht möglich. In diesem Zusammenhang sind Nanoarzneimittel und insbesondere polymere Nanopartikel kritische mRNA-Abgabesysteme. Ziel dieses Artikels ist es daher, das Protokoll für die Formulierung und den Test eines mRNA-Impfstoffkandidaten auf Basis der proprietären polymeren Nanopartikel zu beschreiben. Die Synthese und chemische Charakterisierung der verwendeten Poly(beta-aminoester)-Polymere, ihre Komplexierung mit mRNA zu Nanopartikeln und ihre Lyophilisierungsmethodik werden hier diskutiert. Dies ist ein entscheidender Schritt zur Senkung der Lager- und Verteilungskosten. Schließlich werden die erforderlichen Tests zum Nachweis ihrer Fähigkeit, dendritische Modellzellen in vitro zu transfizieren und zu reifen, angezeigt. Dieses Protokoll wird der wissenschaftlichen Gemeinschaft, die an der Impfung arbeitet, aufgrund seiner hohen Vielseitigkeit zugute kommen, die es diesen Impfstoffen ermöglicht, eine Vielzahl von Krankheiten zu verhindern oder zu heilen.
Introduction
Infektionskrankheiten stellen eine ernsthafte Bedrohung für Millionen von Menschen auf der ganzen Welt dar und sind in einigen Entwicklungsländern immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Die prophylaktische Impfung war eine der wirksamsten Interventionen der modernen Gesellschaft zur Vorbeugung und Bekämpfung von Infektionskrankheiten1,2. Diese entscheidenden Meilensteine der Wissenschaft in der Relevanz des20.Jahrhunderts wurden durch die jüngste weltweite Covid-19-Pandemie, die durch das SARS-CoV-2-Virus verursacht wurde, hervorgehoben3. In Anerkennung der Bedeutung effizienter Impfstoffe, um die Verbreitung der Krankheit einzudämmen, haben die Kooperationsbemühungen aller biomedizinischen Gemeinschaften in weniger als einem Jahr erfolgreich zu vielen prophylaktischen Impfstoffen auf dem Markt geführt4.
Traditionell bestanden Impfstoffe aus abgeschwächten (lebend, reduzierte Virulenz) oder inaktivierten (Todespartikel) Viren. Für einige Krankheiten ohne Spielraum für Sicherheitsfehler sind virale Partikel jedoch nicht möglich, und stattdessen werden Proteinuntereinheiten verwendet. Dennoch ermöglichen Untereinheiten in der Regel nicht die Kombination von mehr als einem Epitop / Antigen, und Adjuvantien sind erforderlich, um die Impfkraft zu erhöhen5,6. Daher ist der Bedarf an neuartigen Impfstofftypen klar.
Wie während der aktuellen Pandemie gezeigt wurde, können neuartige Impfstoffkandidaten auf basis von Nukleinsäuren vorteilhaft sein, um lange Entwicklungsprozesse zu vermeiden und eine hohe Vielseitigkeit zu bieten und gleichzeitig eine lebenswichtige Immunisierung des Patienten zu erzeugen. Dies ist der Fall bei mRNA-Impfstoffen, die ursprünglich als experimentelle Krebsimpfstoffe konzipiert wurden. Dank ihrer natürlichen Fähigkeit, antigenspezifische T-Zell-Antworten zu produzieren3,5,6,7. Da mRNA das Molekül ist, das für das antigene Protein kodiert und sich nur gleich verändert, kann der Impfstoff schnell angepasst werden, um andere Varianten desselben Mikroorganismus, verschiedene Stämme, andere infektiöse Mikroorganismen zu immunisieren oder sogar eine Krebsimmuntherapie zu werden. Darüber hinaus sind sie vorteilhaft in Bezug auf die Produktionskosten im großen Maßstab. mRNA hat jedoch eine erhebliche Hürde, die ihre nackte Verabreichung behindert: Ihre Stabilität und Integrität sind in physiologischen Medien voller Nukleasen beeinträchtigt. Aus diesem Grund ist die Verwendung eines nanometrischen Trägers erforderlich, der sie schützt und mRNA zu den Antigen-präsentierenden Zellenvektorisiert 2,8.
In diesem Zusammenhang sind Poly(beta-Aminoester) (pBAE) eine Klasse von biokompatiblen und biologisch abbaubaren Polymeren, die dank ihrer kationischen Ladungen eine bemerkenswerte Fähigkeit gezeigt haben, mRNA in nanometrischen Partikeln zu komplexieren9,10,11. Diese Polymere bestehen aus Esterbindungen, was ihren Abbau durch Esterasen unter physiologischen Bedingungen erleichtert. Unter den pBAE-Bibliothekskandidaten zeigten diejenigen, die mit endkationischen Oligopeptiden funktionalisiert wurden, eine höhere Fähigkeit, kleine Nanopartikel zu bilden, um durch Endozytose effizient in Zellen einzudringen und das verkapselte Genmaterial zu transfizieren. Darüber hinaus ermöglicht die Versauerung des Endosomenkompartiments dank ihrer Pufferkapazität ein endosomales Entweichen12,13. Nämlich eine spezifische Art von pBAE, einschließlich hydrophober Einheiten auf ihrem Rückgrat (die sogenannte c6 pBAE), um ihre Stabilität zu verbessern, und eine End-Oligopeptid-Kombination (60% des polymeren modifizierten Polymers mit einem Tri-Lysin und 40% des Polymers mit einem Tri-Histidin), die selektiv Antigen-präsentierende Zellen nach parenteraler Verabreichung transfiziert und die mRNA-kodierte Antigenpräsentation gefolgt von einer Mäuse-Immunisierung erzeugt, wurde kürzlich veröffentlicht14 . Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass diese Formulierungen einen der Hauptengpässe von Nanomedizinformulierungen umgehen könnten: die Möglichkeit, sie zu gefriertrocknen, ohne ihre Funktionalität zu verlieren, was eine Langzeitstabilität in weichen, trockenen Umgebungen ermöglicht15.
In diesem Zusammenhang besteht das Ziel des aktuellen Protokolls darin, das Verfahren zur Bildung der mRNA-Nanopartikel der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung zu stellen, indem eine Beschreibung der kritischen Schritte im Protokoll gegeben und die Herstellung effizienter Impfstoffe für die Prävention von Infektionskrankheiten und Tumorbehandlungsanwendungen ermöglicht wird.
Das folgende Protokoll beschreibt das komplette Training zur Synthese von Oligopeptid-endmodifizierten Poly(beta-Aminoestern) – OM-pBAE-Polymeren, die weiterhin für die Nanopartikelsynthese verwendet werden. Im Protokoll ist auch die Formulierung von Nanopartikeln enthalten. Darüber hinaus werden kritische Schritte für den Erfolg des Verfahrens und repräsentative Ergebnisse bereitgestellt, um sicherzustellen, dass die resultierenden Formulierungen die erforderlichen Qualitätskontrollcharakterisierungsmerkmale erfüllen, um ein positives oder negatives Ergebnis zu definieren. Dieses Protokoll ist in Abbildung 1zusammengefasst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nach dem Ausbruch der Covid-19-Pandemie im vergangenen Jahr hat sich die Bedeutung von Impfstoffen für die Bekämpfung von Infektionskrankheiten als kritische Komponente manifestiert8. Bemühungen von Wissenschaftlern weltweit haben die Markteinführung vieler Impfstoffe ermöglicht. Zum ersten Mal in der Geschichte haben mRNA-Impfstoffe ihren bisher hypothetischen Erfolg gezeigt, dank ihres schnellen Designs aufgrund ihrer Fähigkeit, sich innerhalb einiger Monate an jedes neue Antigen anzupasse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanzielle Unterstützung von MINECO/FEDER (Zuschüsse SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 und COV20/01100) wird anerkannt. CGF erkannte ihr IQS PhD Fellowship an.
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
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