סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mRNA למטרות חיסון
Summary
כאן, פרוטוקול פשוט מוצג לייצור חלקיקי mRNA המבוססים על פולי (בטא אמינואסטר) פולימרים, קל להתאמה על ידי שינוי mRNA אנקפסולציה. זרימת העבודה לסינתזה של הפולימרים, הננו-חלקיקים והאפיון החיוני שלהם מתוארים גם הם. כמו כן מתווספת הוכחת תפיסה בנוגע לחיסון.
Abstract
חיסון היה אחת ההצלחות הגדולות של החברה המודרנית והוא הכרחי בשליטה ומניעת מחלות. חיסונים מסורתיים היו מורכבים מכל או שברים של חומר זיהומיות. עם זאת, האתגרים נותרו, וטכנולוגיות חיסונים חדשות הן חובה. בהקשר זה, השימוש ב- mRNA למטרות חיסון הראה ביצועים משופרים, כפי שהוכח באישור מהיר של שני חיסוני mRNA המונעים זיהום SARS-CoV-2. מעבר להצלחה במניעת זיהומים ויראליים, חיסוני mRNA יכולים לשמש גם ליישומי סרטן טיפוליים.
עם זאת, חוסר היציבות של mRNA ואת הסיווג המהיר שלה מהגוף בשל נוכחות של גרעינים עושה את המסירה העירומה שלה לא אפשרי. בהקשר זה, ננו-רפואה, ובמיוחד חלקיקים פולימריים, הן מערכות מסירה קריטיות של mRNA. לכן, מטרת מאמר זה היא לתאר את הפרוטוקול לגיבוש ובדיקה של מועמד לחיסון mRNA המבוסס על חלקיקים פולימריים קנייניים. הסינתזה והאפיון הכימי של פולי (בטא אמינואסטרים) פולימרים המשמשים, המורכבות שלהם עם mRNA כדי ליצור חלקיקים, ומתודולוגיית lyophilization שלהם יידונו כאן. זהו צעד מכריע להפחתת עלויות האחסון וההפצה. לבסוף, הבדיקות הנדרשות כדי להפגין את יכולתם במבחנה transfect ומודל בוגר תאים דנדריטיים יצוינו. פרוטוקול זה יועיל לקהילה המדעית העובדת על חיסון בשל הרבגוניות הגבוהה שלו המאפשרת לחיסונים אלה למנוע או לרפא מגוון רחב של מחלות.
Introduction
מחלות זיהומיות מהוות איום חמור על מיליוני בני אדם ברחבי העולם, והן עדיין אחד הגורמים המובילים למוות בכמה מדינות מתפתחות. חיסון מניעתי היה אחת ההתערבויות היעילות ביותר של החברה המודרנית כדי למנוע ולשלוט במחלות זיהומיות1,2. אבני דרך קריטיות אלה של המדע ברלוונטיות של המאהה-20 נאמרו על ידי מגיפת Covid-19 העולמית האחרונה שנגרמה על ידי נגיף SARS-CoV-23. מתוך הכרה בחשיבות של חיסונים יעילים לצמצום הפצת המחלה, מאמצי שיתוף פעולה מכל הקהילות הביו-רפואיות הביאו בהצלחה לחיסונים מניעתיים רבים בשוק תוך פחות משנה4.
באופן מסורתי, חיסונים היו מורכבים מווירוסים מוחלשים (חיים, הפחתת ארס) או מומתים (חלקיקי מוות). עם זאת, עבור מחלות מסוימות ללא מרווח לשגיאות בטיחות, חלקיקים ויראליים אינם אפשריים, ו- subunits חלבון משמשים במקום. עם זאת, subunits בדרך כלל לא מאפשר שילוב של יותר אפיטופ אחד / אנטיגן, ואדג’ובנטים נדרשים כדי לשפר את עוצמת החיסון5,6. לכן, הצורך בסוגי חיסונים חדשניים ברור.
כפי שהוכח במהלך המגפה הנוכחית, מועמדים חדשים לחיסון המבוססים על חומצות גרעין יכולים להיות יתרון מבחינת הימנעות מתהליכי פיתוח ארוכים ומתן רב-תכליתיות גבוהה תוך ייצור, במקביל, חיסון חיוני למטופל. זהו המקרה של חיסוני mRNA, שתוכננו בתחילה כחיסונים ניסיוניים לסרטן. הודות ליכולת הטבעית שלהם לייצר תגובות תאי T ספציפיות אנטיגן3,5,6,7. בהיותה mRNA המולקולה המקודדת את החלבון האנטיגני, רק משתנה זהה, ניתן להתאים את החיסון במהירות כדי לחסן וריאנטים אחרים של אותו מיקרואורגניזם, זנים שונים, מיקרואורגניזמים זיהומיים אחרים, או אפילו להפוך לטיפול אימונותרפי לסרטן. בנוסף, הם יתרון במונחים של עלויות ייצור בקנה מידה גדול. עם זאת, ל-mRNA יש משוכה משמעותית המעכבת את הממשל העירום שלהם: יציבותו ויושרו נפגעות בתקשורת הפיזיולוגית, מלאות גרעין. מסיבה זו, השימוש במנשא ננומטרי שמגן עליו וקטורינג mRNA לתאים המציגים אנטיגן נדרש2,8.
בהקשר זה, פולי (אמינו בטא) (pBAE) הם סוג של פולימרים ביו-תואמים ומתכלים שהפגינו יכולת יוצאת דופן ל-mRNA מורכב בחלקיקים ננומטריים, הודות למטענים הקטיים שלהם9,10,11. פולימרים אלה מורכבים קשרים אסתר, מה שהופך את השפלתם קלה על ידי אסטראזות בתנאים פיזיולוגיים. בין המועמדים לספריית pBAE, אלה שתפקדו עם אוליגופפטידים קטיקטיים בסופו הראו יכולת גבוהה יותר ליצור חלקיקים קטנים לחדור ביעילות לתאים באמצעות אנדוציטוזיס ולהדביק את חומר הגן encapsulated. יתר על כן, הודות ליכולת האגירה שלהם, החמצת התא אנדוזום מאפשרת בריחה אנדוזומית12,13. כלומר, סוג מסוים של pBAE, כולל עגבת הידרופובית על עמוד השדרה שלהם (מה שנקרא C6 pBAE) כדי לשפר את היציבות שלהם ואת השילוב הסופי-אוליגופפטידים (60% של פולימר שונה עם תלת ליצין ו 40% של הפולימר עם tri-histidine) כי באופן סלקטיבי טרנסקלציה אנטיגן מציג תאים לאחר ניהול parenteral לייצר את מצגת אנטיגן מקודד mRNA ואחריו חיסון עכברים פורסם לאחרונה14 . בנוסף, הוכח גם כי ניסוחים אלה יכולים לעקוף את אחד השלבים צוואר הבקבוק העיקרי של ניסוחים nanomedicine: האפשרות להקפיא לייבש אותם מבלי לאבד את הפונקציונליות שלהם, המאפשר יציבות לטווח ארוך בסביבות יבשותרכות 15.
בהקשר זה, מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להפוך את ההליך להיווצרות חלקיקי mRNA לזמינים לקהילה המדעית על ידי מתן תיאור הצעדים הקריטיים בפרוטוקול ומאפשר ייצור חיסונים יעילים ליישומים למניעת מחלות זיהומיות וטיפול בגידולים.
הפרוטוקול הבא מתאר את האימון המלא לסנתז אוליגופפטיד שינוי קצה פולי (אמינו בטא) – פולימרים OM-pBAE שישמשו עוד יותר עבור סינתזה ננו-חלקיקים. בפרוטוקול, ניסוח ננו-חלקיקים כלול גם. בנוסף, ניתנים גם צעדים קריטיים להצלחת ההליך והתוצאות הייצוגיות כדי להבטיח שהניסוחים המתקבלים ישיגו את תכונות אפיון בקרת האיכות הנדרשות כדי להגדיר תוצאה חיובית או שלילית. פרוטוקול זה מסוכם באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
לאחר פרוץ מגפת Covid-19 בשנה שעברה, החשיבות של חיסונים במונחים של בקרת מחלות זיהומיות באה לידי ביטוי כמרכיב קריטי8. מאמצי מדענים ברחבי העולם אפשרו את שחרורם לשוק של חיסונים רבים. בפעם הראשונה בהיסטוריה, חיסוני mRNA הוכיחו את הצלחתם המשוערת בעבר, הודות לעיצוב המהיר שלהם בגלל יכולתם ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה כספית מ- MINECO /FEDER (מענקים SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 ו- COV20/01100) מוכרת. CGF הודתה מלגת IQS הדוקטורט שלה.
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D’Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
