Síntese e Caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mRNA (Beta Aminoesters) para fins de vacinação
Summary
Aqui, um protocolo simples é apresentado para a produção de nanopartículas mRNA baseadas em polímeros poli (beta aminoester), fáceis de serem adaptados alterando o mRNA encapsulado. O fluxo de trabalho para sintetizar os polímeros, as nanopartículas e sua caracterização essencial in vitro também são descritos. Também é acrescentada uma prova de conceito em relação à imunização.
Abstract
A vacinação tem sido um dos maiores sucessos da sociedade moderna e é indispensável no controle e prevenção de doenças. As vacinas tradicionais eram compostas de inteira ou frações do agente infeccioso. No entanto, os desafios permanecem, e novas tecnologias de vacinação são obrigatórias. Nesse contexto, o uso do mRNA para fins de imunização mostrou um desempenho aprimorado, como demonstrado pela aprovação rápida de duas vacinas de mRNA que previnem a infecção pelo SARS-CoV-2. Além do sucesso na prevenção de infecções virais, as vacinas mRNA também podem ser usadas para aplicações terapêuticas de câncer.
No entanto, a instabilidade do mRNA e sua rápida liberação do corpo devido à presença de núcleos torna sua entrega nua não possível. Neste contexto, as nanomedicinas, e especificamente as nanopartículas poliméricas, são sistemas críticos de entrega de mRNA. Assim, o objetivo deste artigo é descrever o protocolo de formulação e teste de um candidato à vacina mRNA com base nas nanopartículas poliméricas proprietárias. A síntese e caracterização química dos polímeros poli(beta aminoesters) utilizados, sua complexidade com mRNA para formar nanopartículas, e sua metodologia de liofilização serão discutidas aqui. Este é um passo crucial para diminuir os custos de armazenamento e distribuição. Finalmente, serão indicados os testes necessários para demonstrar sua capacidade de transfetál de in vitro e células dendríticas de modelo maduros. Este protocolo beneficiará a comunidade científica que trabalha na vacinação devido à sua alta versatilidade que permite que essas vacinas previnem ou curem uma grande variedade de doenças.
Introduction
As doenças infecciosas têm representado uma grave ameaça a milhões de seres humanos em todo o mundo e ainda são uma das principais causas de morte em alguns países em desenvolvimento. A vacinação profilática tem sido uma das intervenções mais eficazes da sociedade moderna para prevenir e controlar doenças infecciosas1,2. Esses marcos críticos da ciênciana relevância do século 20 foram observados pela recente pandemia covid-19 mundial causada pelo vírus SARS-CoV-23. Reconhecendo a importância de ter vacinas eficientes para reduzir a disseminação da doença, os esforços cooperativos de todas as comunidades biomédicas resultaram com sucesso em muitas vacinas profiláticas no mercado em menos de um ano4.
Tradicionalmente, as vacinas eram compostas de vírus atenuados (virulência viva, reduzida) ou inativados (partículas de morte). No entanto, para algumas doenças sem margem para erros de segurança, partículas virais não são possíveis, e subunidades proteicas são usadas em vez disso. No entanto, as subunidades geralmente não permitem a combinação de mais de um epítope/antígeno, e os adjuvantes são necessários para aumentar a potência vacinal5,6. Portanto, a necessidade de novos tipos de vacinas é clara.
Como demonstrado durante a pandemia atual, novos candidatos à vacina com base em ácidos nucleicos podem ser vantajosos em termos de evitar processos longos de desenvolvimento e fornecer alta versatilidade ao produzir, ao mesmo tempo, uma imunização vital do paciente. É o caso das vacinas mRNA, que foram inicialmente projetadas como vacinas experimentais contra o câncer. Graças à sua capacidade natural de produzir respostas de células T específicas de antígeno3,5,6,7. Sendo mRNA a molécula que codifica a proteína antigênica, apenas mudando a mesma, a vacina pode ser rapidamente adaptada para imunizar outras variantes do mesmo microrganismo, cepas diferentes, outros microrganismos infecciosos, ou até mesmo se tornar um tratamento imunoterapêutico de câncer. Além disso, são vantajosos em termos de custos de produção em larga escala. No entanto, o mRNA tem um obstáculo significativo que dificulta sua administração nua: sua estabilidade e integridade estão comprometidas na mídia fisiológica, cheia de núcleos. Por essa razão, é necessário o uso de um portador nanométrico que o proteja e vetorize o mRNA para as células que apresentem antígeno2,8.
Neste contexto, os poli(aminoesters beta) (pBAE) são uma classe de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis que demonstraram uma notável capacidade de complexo mRNA em partículas nanométricas, graças às suas cargas cationicas9,10,11. Estes polímeros são compostos de laços éster, o que facilita sua degradação por esterases em condições fisiológicas. Entre os candidatos à biblioteca do PBAE, aqueles funcionalizados com oligopeptídeos cáticos finais apresentaram maior capacidade de formar pequenas nanopartículas para penetrar eficientemente as células através da endocitose e transfectar o material genético encapsulado. Além disso, graças à sua capacidade de tampão, a acidificação do compartimento endosomo permite a fuga endossomal12,13. Ou seja, um tipo específico de pBAE, incluindo moieties hidrofóbicos em sua espinha dorsal (o chamado C6 pBAE) para aumentar sua estabilidade e combinação de oligopeptídeo final (60% de polímero modificado com uma tri-lysina e 40% do polímero com uma tri-histidina) que transfecta seletivamente células que apresentam antígenos após administração parenteral e produzem a apresentação de antígeno de encode mRNA seguido de imunização de camundongos foi publicado recentemente14 . Além disso, também foi demonstrado que essas formulações poderiam contornar uma das principais etapas de gargalo das formulações de nanomedicina: a possibilidade de congelá-las sem perder sua funcionalidade, o que permite a estabilidade a longo prazo em ambientes secos suaves15.
Nesse contexto, o objetivo do protocolo atual é disponibilizar o procedimento para a formação das nanopartículas de mRNA à comunidade científica, dando uma descrição das etapas críticas do protocolo e possibilitando a produção de vacinas eficientes para aplicações de prevenção de doenças infecciosas e tratamento de tumores.
O protocolo a seguir descreve o exercício completo para sintetizar poli (aminoestores beta) modificados por oligopeptídeos – polímeros OM-pBAE que serão usados ainda para síntese de nanopartículas. No protocolo, a formulação de nanopartículas também está incluída. Além disso, etapas críticas para o sucesso do procedimento e resultados representativos também são fornecidas para garantir que as formulações resultantes realizem os recursos de caracterização de controle de qualidade necessários para definir um resultado positivo ou negativo. Este protocolo é resumido na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Após o surto da pandemia Covid-19 no ano passado, a importância das vacinas em termos de controle de doenças infecciosas tem se manifestado como um componente crítico8. Os esforços de cientistas em todo o mundo permitiram a liberação para o mercado de muitas vacinas. Pela primeira vez na história, as vacinas mRNA demonstraram seu sucesso anteriormente hipótese, graças ao seu rápido design devido à sua capacidade de se adaptar a qualquer novo antígeno dentro de alguns…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio financeiro da MINECO/FEDER (subvenções SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 e COV20/01100) é reconhecido. A CGF reconheceu sua Bolsa de Doutorado em QI.
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
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