Summary

Synthèse et caractérisation de nanoparticules poly(bêta-aminoesters) chargées d’ARNm à des fins de vaccination

Published: August 13, 2021
doi:

Summary

Ici, un protocole simple est présenté pour produire des nanoparticules d’ARNm à base de polymères poly(bêta aminoesster), faciles à adapter en changeant l’ARNm encapsulé. Le flux de travail de synthèse des polymères, des nanoparticules et de leur caractérisation essentielle in vitro est également décrit. Une preuve de concept concernant la vaccination est également ajoutée.

Abstract

La vaccination a été l’un des succès majeurs de la société moderne et est indispensable pour contrôler et prévenir les maladies. Les vaccins traditionnels étaient composés de tout ou de fractions de l’agent infectieux. Cependant, des défis demeurent et les nouvelles technologies vaccinales sont obligatoires. Dans ce contexte, l’utilisation de l’ARNm à des fins d’immunisation a montré une performance accrue, comme en témoigne l’approbation rapide de deux vaccins à ARNm prévenant l’infection par le SRAS-CoV-2. Au-delà du succès dans la prévention des infections virales, les vaccins à ARNm peuvent également être utilisés pour des applications thérapeutiques contre le cancer.

Néanmoins, l’instabilité de l’ARNm et sa clairance rapide du corps en raison de la présence de nucléases rendent son administration nue impossible. Dans ce contexte, les nanomédicaments, et en particulier les nanoparticules polymères, sont des systèmes critiques d’administration d’ARNm. Ainsi, le but de cet article est de décrire le protocole de formulation et de test d’un candidat vaccin à ARNm basé sur les nanoparticules polymères propriétaires. La synthèse et la caractérisation chimique des polymères poly(bêta-aminoesters) utilisés, leur complexation avec l’ARNm pour former des nanoparticules et leur méthodologie de lyophilisation seront discutés ici. Il s’agit d’une étape cruciale pour réduire les coûts de stockage et de distribution. Enfin, les tests requis pour démontrer leur capacité à transfecter in vitro et à modéliser des cellules dendritiques matures seront indiqués. Ce protocole profitera à la communauté scientifique travaillant sur la vaccination en raison de sa grande polyvalence qui permet à ces vaccins de prévenir ou de guérir une grande variété de maladies.

Introduction

Les maladies infectieuses ont représenté une grave menace pour des millions d’êtres humains dans le monde et restent l’une des principales causes de décès dans certains pays en développement. La vaccination prophylactique a été l’une des interventions les plus efficaces de la société moderne pour prévenir et contrôler les maladies infectieuses1,2. Ces jalons critiques de la science dans la pertinencedu 20esiècle ont été remarqués par la récente pandémie mondiale de Covid-19 causée par le virus SARS-CoV-23. Reconnaissant l’importance de disposer de vaccins efficaces pour réduire la dissémination de la maladie, les efforts de coopération de toutes les communautés biomédicales ont abouti à la mise sur le marché de nombreux vaccins prophylactiques en moins d’un an4.

Traditionnellement, les vaccins étaient composés de virus atténués (vivants, à virulence réduite) ou inactivés (particules de mort). Cependant, pour certaines maladies sans marge d’erreurs de sécurité, les particules virales ne sont pas possibles et des sous-unités protéiques sont utilisées à la place. Néanmoins, les sous-unités ne permettent généralement pas la combinaison de plus d’un épitope / antigène, et des adjuvants sont nécessaires pour améliorer la puissance vaccinale5,6. Par conséquent, le besoin de nouveaux types de vaccins est évident.

Comme démontré pendant la pandémie actuelle, de nouveaux candidats vaccins à base d’acides nucléiques peuvent être avantageux pour éviter de longs processus de développement et offrir une grande polyvalence tout en produisant, en même temps, une immunisation vitale pour les patients. C’est le cas des vaccins à ARNm, qui ont été initialement conçus comme des vaccins expérimentaux contre le cancer. Grâce à leur capacité naturelle à produire des réponses de lymphocytes T spécifiques à l’antigène3,5,6,7. Étant l’ARNm la molécule qui code pour la protéine antigénique, ne changeant que la même chose, le vaccin peut être rapidement adapté pour immuniser d’autres variantes du même micro-organisme, différentes souches, d’autres micro-organismes infectieux, ou même devenir un traitement immunothérapeutique du cancer. De plus, ils sont avantageux en termes de coûts de production à grande échelle. Cependant, l’ARNm a un obstacle important qui entrave leur administration nue: sa stabilité et son intégrité sont compromises dans des milieux physiologiques, pleins de nucléases. Pour cette raison, l’utilisation d’un support nanométrique qui le protège et vectorise l’ARNm vers les cellules présentatrices d’antigène est nécessaire2,8.

Dans ce contexte, les poly(bêta-aminoesters) (pBAE) sont une classe de polymères biocompatibles et biodégradables qui ont démontré une capacité remarquable à complexer l’ARNm dans des particules nanométriques, grâce à leurs charges cationiques 9,10,11. Ces polymères sont composés de liaisons esters, ce qui facilite leur dégradation par les estérases dans des conditions physiologiques. Parmi les candidats de la bibliothèque pBAE, ceux fonctionnalisés avec des oligopeptides cationiques finaux ont montré une plus grande capacité à former de petites nanoparticules pour pénétrer efficacement dans les cellules par endocytose et transfecter le matériel génétique encapsulé. De plus, grâce à leur capacité tampon, l’acidification du compartiment endosomique permet une fuite endosomale12,13. À savoir, un type spécifique de pBAE, y compris des fractions hydrophobes sur leur épine dorsale (le soi-disant C6 pBAE) pour améliorer leur stabilité et la combinaison d’oligopeptides finaux (60% de polymère modifié avec une tri-lysine et 40% du polymère avec une tri-histidine) qui transfecte sélectivement les cellules présentatrices d’antigènes après administration parentérale et produit la présentation de l’antigène codé par ARNm suivie de l’immunisation des souris a été récemment publié14 . En outre, il a également été démontré que ces formulations pouvaient contourner l’une des principales étapes goulots d’étranglement des formulations de nanomédecine: la possibilité de les lyophiliser sans perdre leur fonctionnalité, ce qui permet une stabilité à long terme dans des environnements mous et secs15.

Dans ce contexte, l’objectif du protocole actuel est de mettre la procédure de formation des nanoparticules d’ARNm à la disposition de la communauté scientifique en donnant une description des étapes critiques du protocole et en permettant la production de vaccins efficaces pour la prévention des maladies infectieuses et les applications de traitement des tumeurs.

Le protocole suivant décrit l’entraînement complet pour synthétiser des polymères poly(aminoesters bêta) modifiés par l’extrémité d’oligopeptides – OM-pBAE qui seront ensuite utilisés pour la synthèse de nanoparticules. Dans le protocole, la formulation de nanoparticules est également incluse. En outre, des étapes critiques pour le succès de la procédure et des résultats représentatifs sont également fournis pour s’assurer que les formulations résultantes remplissent les caractéristiques de caractérisation de contrôle de la qualité requises pour définir un résultat positif ou négatif. Ce protocole est résumé à la figure 1.

Protocol

1. Synthèse du polymère pBAE avec des oligopeptides finaux (OM-pBAE) Polymérisation du C6-pBAE Ajouter le 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexylamine (38 mmol; MW = 101,19 Da) dans une fiole en verre à fond rond (100 mL). Ensuite, ajouter le diacrylate de 1,4-butanediol (82 mmol; MW = 198,22 Da). Préchauffez le bain d’huile de silicone à 90 °C, placez la fiole à fond rond dans le bain d’huile et remuez le mélange à l’aide d’une barre d’agitation magnétique p…

Representative Results

Synthèse et caractérisation des polymèresLa procédure de synthèse OM-pBAE est donnée à la figure 2. Comme le montre la figure 2A, la première étape pour obtenir l’OM-pBAE consiste à synthétiser le C6-pBAE en ajoutant les amines (1-hexylamine et 5-amino-1-pentanol, rapport 1:1) au diacrylate (diacrylate de 1,4-butanediol). Cette réaction est réalisée à 90 °C pendant 20 h et sous agitation constante. Ensuite, une solution d?…

Discussion

Après l’apparition de la pandémie de Covid-19 l’année dernière, l’importance des vaccins en termes de contrôle des maladies infectieuses s’est manifestée comme une composante critique8. Les efforts des scientifiques du monde entier ont permis la mise sur le marché de nombreux vaccins. Pour la première fois dans l’histoire, les vaccins à ARNm ont démontré leur succès supposé auparavant, grâce à leur conception rapide en raison de leur capacité à s’adapter à tout nouvel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le soutien financier de MINECO/FEDER (subventions SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 et COV20/01100) est reconnu. CGF a reconnu sa bourse de doctorat IQS.

Materials

1,4-butanediol diacrylate Sigma Aldrich 123048
1-hexylamine Sigma Aldrich 219703
5-amino-1-pentanol Sigma Aldrich 411744
Acetone Panreac 141007
CD11b antibody BD 550993
CD86 antibody Bioligend 105007
Chlor hydroxhyde Panreac 181023
Chloroform-d Sigma Aldrich 151823
Cys-His-His-His peptide Ontores Custom
Cys-Lys-Lys-Lys peptide Ontores Custom
D2O Sigma Aldrich 151882
DEPC reagent for Rnase free water Sigma Aldrich D5758 This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers
Diethyl eter Panreac 212770
dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich 276855
HEPES Sigma Aldrich H3375
mRNA EGFP TriLink Technologies L-7601
mRNA OVA TriLink Technologies L-7610
RiboGreen kit ThermoFisher R11490
sodium acetate Sigma Aldrich 71196
sucrose Sigma Aldrich S0389
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 11570626
α-mouse AlexaFluor488 antibody Abcam Ab450105
Equipment
Nanoparticle Tracking Analyzer Malvern Panalytical NanoSight NS300
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer Varian 400 MHz
ZetaSizer Malvern Panalytical Nano ZS For zeta potential and hydrodynamic size determination
Software
NanoSight NTA software Malvern Panalytical MAN0515-02-EN-00
NovoExpress Software Agilent Not specified
ZetaSizer software Malvern Panalytical DTS Application To analyze surface charge and hydrodynamic sizes

References

  1. Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
  2. Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
  3. Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D’Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
  4. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  5. Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
  6. Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
  7. Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
  8. Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
  9. Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
  10. Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
  11. Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
  12. Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
  13. Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
  14. Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
  15. Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
  16. Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
  17. Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
  18. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  19. Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
  20. Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
  21. Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
  22. Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
  23. Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
  24. Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
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Fornaguera, C., Díaz-Caballero, M., García-Fernandez, C., Olmo, L., Stampa-López Pinto, M., Navalón-López, M., Guerra-Rebollo, M., Borrós, S. Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes. J. Vis. Exp. (174), e62889, doi:10.3791/62889 (2021).

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