تركيب وتوصيف متعدد الجسيمات النانوية المحملة بالحمض النووي الريبي (بيتا أمينوستر) لأغراض التطعيم
Summary
هنا، يتم تقديم بروتوكول بسيط لإنتاج الجسيمات النانوية مرنا على أساس بولي (بيتا أمينويستر) البوليمرات، من السهل أن تكون مصممة عن طريق تغيير مرنا مغلفة. كما يتم وصف سير العمل لتجميع البوليمرات والجسيمات النانوية وتوصيفها الأساسي في المختبر. يضاف أيضا دليل على المفهوم فيما يتعلق بالتحصين.
Abstract
لقد كان التطعيم أحد النجاحات الرئيسية للمجتمع الحديث ولا غنى عنه في السيطرة على الأمراض والوقاية منها. وكانت اللقاحات التقليدية تتألف من كامل أو أجزاء من العامل المعدي. ومع ذلك، لا تزال هناك تحديات، وتكنولوجيات اللقاحات الجديدة إلزامية. وفي هذا السياق، أظهر استخدام الحمض النووي الريبي لأغراض التحصين أداء معززا، كما يتضح من الموافقة السريعة على لقاحين من لقاح الحمض النووي الريبي (مرنا) الوقاية من العدوى بالسارس -CoV-2. وإلى جانب النجاح في الوقاية من العدوى الفيروسية، يمكن أيضا استخدام لقاحات الحمض النووي الريبي لتطبيقات السرطان العلاجية.
ومع ذلك ، فإن عدم استقرار الحمض النووي الريبي وتخليصه السريع من الجسم بسبب وجود النيوكلياسيات يجعل تسليمه العاري غير ممكن. وفي هذا السياق، فإن الطب النانوي، وبالتحديد الجسيمات النانوية البوليمرية، هي نظم تسليم الحمض النووي الريبي الحرجة. وبالتالي ، فإن الهدف من هذه المادة هو وصف بروتوكول لصياغة واختبار لقاح مرنا مرشح على أساس الجسيمات النانوية البوليمرية الملكية. سيتم مناقشة التركيب والتوصيف الكيميائي للبولي (بيتا أمينيسترز) البوليمرات المستخدمة ، وتعقيدها مع مرنا لتشكيل الجسيمات النانوية ، ومنهجية الليسوفيليا الخاصة بهم هنا. وهذه خطوة حاسمة لخفض تكاليف التخزين والتوزيع. وأخيرا، سيتم الإشارة إلى الاختبارات المطلوبة لإثبات قدرتها على الخلايا التشعبية في المختبر والنموذج الناضج. وسيفيد هذا البروتوكول الأوساط العلمية العاملة في مجال التطعيم بسبب تعدد استخداماته العالية التي تمكن هذه اللقاحات من الوقاية من مجموعة واسعة من الأمراض أو علاجها.
Introduction
11 – وقد مثلت الأمراض المعدية تهديدا خطيرا لملايين البشر في جميع أنحاء العالم، ولا تزال أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في بعض البلدان النامية. التطعيم الوقائي كان واحدا من التدخلات الأكثر فعالية في المجتمع الحديث لمنع ومكافحة الأمراض المعدية1،2. وقد لوحظت هذه المعالم الحاسمة للعلوم فيأهميةالقرن العشرين من قبل وباء كوفيد-19 في جميع أنحاء العالم مؤخرا الناجم عن فيروس سارس-كوف-23. وإدراكا لأهمية وجود لقاحات فعالة للحد من انتشار المرض، نجحت الجهود التعاونية التي بذلتها جميع المجتمعات الطبية الحيوية في إنتاج العديد من اللقاحات الوقائية في السوق في أقل من عام4.
وتقليديا، كانت اللقاحات تتألف من فيروسات مخففة (حية، أو منخفضة الفوعة) أو فيروسات (جزيئات الموت) المعطلة. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض الأمراض التي لا يوجد بها هامش أخطاء السلامة ، فإن الجسيمات الفيروسية غير ممكنة ، وتستخدم وحدات البروتين الفرعية بدلا من ذلك. ومع ذلك، عادة لا تمكن الوحدات الفرعية من الجمع بين أكثر من ظهارة/ مستضد واحد، ويتعين على المساعدين تعزيز فعالية التطعيم5و6. ولذلك، فإن الحاجة إلى أنواع جديدة من اللقاحات واضحة.
وكما اتضح خلال الجائحة الحالية، يمكن أن يكون المرشحون للقاحات الجديدة القائمة على الأحماض النووية مفيدين من حيث تجنب عمليات التنمية الطويلة وتوفير تنوع كبير مع إنتاج تحصين حيوي للمرضى في الوقت نفسه. هذه هي حالة لقاحات الحمض النووي الريبي، التي صممت في البداية كلقاحات تجريبية للسرطان. بفضل قدرتها الطبيعية لإنتاج مستضد محددة الخلايا التائية الاستجابات3,5,6,7. يجري مرنا الجزيء الذي يشفر البروتين المضادة للجينات، وتغيير نفسه فقط، يمكن تصميم اللقاح بسرعة لتحصين المتغيرات الأخرى من نفس الكائنات الحية الدقيقة، وسلالات مختلفة، والكائنات الحية الدقيقة المعدية الأخرى، أو حتى تصبح علاج المناعة السرطان. وبالإضافة إلى ذلك، فهي مفيدة من حيث تكاليف الإنتاج على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي لديه عقبة كبيرة تعوق إدارتهم العارية: يتم اختراق استقرارها وسلامتها في وسائل الإعلام الفسيولوجية ، المليئة بالنيوات. لهذا السبب، فإن استخدام الناقل نانومتري الذي يحميه وناقلات مرنا إلى خلايا تقديم مستضد مطلوب2،8.
في هذا السياق، بولي (بيتا أمينيسترز) (pBAE) هي فئة من البوليمرات المتوافقة بيولوجيا والقابلة للتحلل الحيوي التي أظهرت قدرة ملحوظة على مرنا معقدة في جزيئات نانومترية، وذلك بفضل التهم cationicبهم 9،10،11. وتتكون هذه البوليمرات من السندات إستر، مما يجعل تدهورها سهلة من قبل esterases في الظروف الفسيولوجية. من بين المرشحين مكتبة pBAE، تلك وظيفية مع oligopeptides cationic نهاية أظهرت قدرة أعلى لتشكيل الجسيمات النانوية الصغيرة لاختراق الخلايا بكفاءة من خلال الغدد الصماء وtransfect المواد الجينية المغلفة. وعلاوة على ذلك، وذلك بفضل قدرتها التخزين المؤقت، وتحمض مقصورة اندوسوم يسمح الهروب endosomal12،13. أي نوع محدد من pBAE، بما في ذلك moieties الكارهة للماء على العمود الفقري (ما يسمى C6 pBAE) لتعزيز استقرارها ومزيج نهاية oligopeptide (60٪ من البوليمر المعدلة مع ثلاثي ليسين و 40 ٪ من البوليمر مع ثلاثي الهستيدين) التي تحول انتقائي الخلايا التي تقدم مستضد بعد الإدارة بين قوسين وإنتاج عرض مستضد مرمزة مرنا تليها الفئران التحصين وقد نشرت مؤخرا14 . وبالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت أيضا أن هذه التركيبات يمكن أن تتحايل على واحدة من خطوات عنق الزجاجة الرئيسية لصياغات الطب النانوي: إمكانية تجميد الجافة لهم دون أن تفقد وظائفها، والتي تمكن الاستقرار على المدى الطويل في البيئات الجافة الناعمة15.
وفي هذا السياق، يتمثل الهدف من البروتوكول الحالي في إتاحة إجراء تكوين الجسيمات النانوية الحمض النووي الريبي للأوساط العلمية من خلال إعطاء وصف للخطوات الحاسمة في البروتوكول وتمكين إنتاج لقاحات فعالة للوقاية من الأمراض المعدية وتطبيقات علاج الأورام.
يصف البروتوكول التالي تجريب كاملة لتجميع أوليغوبتيد نهاية تعديل بولي (بيتا aminoesters) – OM-pBAE البوليمرات التي سيتم استخدامها كذلك لتوليف الجسيمات النانوية. في البروتوكول، يتم تضمين صياغة الجسيمات النانوية أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، يتم أيضا توفير خطوات حاسمة لنجاح الإجراء والنتائج التمثيلية لضمان أن الصياغات الناتجة عن ذلك تحقق الخصائص المطلوبة لتحديد الخصائص المطلوبة لتحديد نتيجة إيجابية أو سلبية. ويرد تلخيص هذا البروتوكول في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعد تفشي وباء كوفيد-19 في العام الماضي، تجلت أهمية اللقاحات من حيث مكافحة الأمراض المعدية كعنصر حاسم8. وقد مكنت الجهود التي بذلها العلماء في جميع أنحاء العالم من إطلاق العديد من اللقاحات إلى السوق. لأول مرة في التاريخ، أثبتت لقاحات مرنا نجاحها المفترض سابقا، وذلك بفضل تصميمها ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم الاعتراف بالدعم المالي من MINECO/FEDER (منح SAF2015-64927-C2-2-R وRTI2018-094734-B-C22 وCOV20/01100). اعترفت CGF لها IQS زمالة الدكتوراه.
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D’Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
