Her præsenteres en simpel protokol til fremstilling af mRNA nanopartikler baseret på poly (beta aminoester) polymerer, let at skræddersy ved at ændre den indkapslede mRNA. Arbejdsgangen for syntetisering af polymerer, nanopartikler, og deres in vitro væsentlige karakterisering er også beskrevet. Der tilføjes også et proof-of-concept vedrørende immunisering.
Vaccination har været en af de største succeser i det moderne samfund og er uundværlig for at kontrollere og forebygge sygdomme. Traditionelle vacciner bestod af hele eller brøkdele af det smitsomme middel. Der er dog stadig udfordringer, og nye vaccineteknologier er obligatoriske. I den forbindelse har brugen af mRNA til immunisering vist en forbedret ydeevne, som det fremgår af den hurtige godkendelse af to mRNA-vacciner, der forhindrer SARS-CoV-2-infektion. Ud over succes med at forebygge virusinfektioner kan mRNA-vacciner også bruges til terapeutiske kræftapplikationer.
Ikke desto mindre gør ustabiliteten af mRNA og dens hurtige clearance fra kroppen på grund af tilstedeværelsen af nukleaser sin nøgne levering ikke mulig. I denne sammenhæng er nanomedicin, og specielt polymere nanopartikler, kritiske mRNA-leveringssystemer. Formålet med denne artikel er således at beskrive protokollen for formulering og test af en mRNA vaccine kandidat baseret på de proprietære polymere nanopartikler. Syntesen og kemisk karakterisering af poly (beta aminoesters) polymerer, deres complexation med mRNA til at danne nanopartikler, og deres lyophilization metode vil blive diskuteret her. Dette er et afgørende skridt for at reducere lager- og distributionsomkostningerne. Endelig vil de nødvendige test for at påvise deres evne til at in vitro transfect og modne model dendritiske celler blive angivet. Denne protokol vil gavne det videnskabelige samfund, der arbejder på vaccination på grund af sin høje alsidighed, der gør det muligt for disse vacciner at forebygge eller helbrede en bred vifte af sygdomme.
Smitsomme sygdomme har været en alvorlig trussel mod millioner af mennesker verden over og er stadig en af de hyppigste dødsårsager i nogle udviklingslande. Profylaktisk vaccination har været en af de mest effektive interventioner i det moderne samfund til at forebygge og kontrollere smitsomme sygdomme1,2. Disse kritiske milepæle for videnskabeni det 20. århundredes relevans er blevet bemærket af den nylige verdensomspændende Covid-19-pandemi forårsaget af SARS-CoV-2-virus3. I erkendelse af vigtigheden af at have effektive vacciner til at begrænse spredningen af sygdommen, har samarbejdsindsatsen fra alle biomedicinske samfund med succes resulteret i mange profylaktiske vacciner på markedet på mindre end et år4.
Traditionelt blev vacciner sammensat af dæmper (levende, reduceret virulens) eller inaktiverede (dødspartikler) vira. Men for nogle sygdomme uden margen for sikkerhedsfejl er viruspartikler ikke mulige, og proteinunderenheder anvendes i stedet. Ikke desto mindre muliggør underenheder normalt ikke kombinationen af mere end én epitop /antigen, og adjuvanser er nødvendige for at øge vaccinationsstyrken5,6. Derfor står behovet for nye vaccinetyper klart.
Som det fremgår af den nuværende pandemi, kan nye vaccinekandidater baseret på nukleinsyrer være fordelagtige med hensyn til at undgå lange udviklingsprocesser og give høj alsidighed, samtidig med at der produceres en vital patientimmunalisering. Dette er tilfældet med mRNA-vacciner, som oprindeligt blev designet som eksperimentelle kræftvacciner. Takket være deres naturlige evne til at producere antigenspecifikke T-celleresponser3,5,6,7. At være mRNA det molekyle, der koder det antigene protein, kun ændre det samme, vaccinen kan hurtigt skræddersys til at immunisere andre varianter af samme mikroorganisme, forskellige stammer, andre smitsomme mikroorganismer, eller endda blive en kræft immunterapeutisk behandling. Derudover er de fordelagtige med hensyn til store produktionsomkostninger. MRNA har imidlertid en betydelig forhindring, der hæmmer deres nøgne administration: dens stabilitet og integritet er kompromitteret i fysiologiske medier, fuld af nukleaser. Af denne grund kræves brugen af en nanometrisk bærer, der beskytter den og vektoriserer mRNA til de antigenpræsentationsceller,2,8.
I denne sammenhæng er poly (beta aminoesters) (pBAE) en klasse af biokompatibile og biologisk nedbrydelige polymerer, der viste en bemærkelsesværdig evne til at komplekse mRNA i nanometriske partikler takket være deres kationiske ladninger9,10,11. Disse polymerer består af esterbindinger, hvilket gør deres nedbrydning let ved esterases under fysiologiske forhold. Blandt pBAE bibliotek kandidater, dem funktionaliseret med end kationiske oligopeptider viste en højere kapacitet til at danne små nanopartikler til effektivt at trænge ind i celler gennem endokytose og transfect den indkapslede genmateriale. Desuden, takket være deres bufferkapacitet, forsuring af endosome rum tillader endosomal undslippe12,13. Nemlig en bestemt form for pBAE, herunder hydrofobiske moieties på deres rygrad (den såkaldte C6 pBAE) for at øge deres stabilitet og end-oligopeptid kombination (60% af polymer modificeret med en tri-lysin og 40% af polymeren med en tri-histidin), der selektivt transfects antigen-præsentere celler efter parenteral administration og producere mRNA kodet antigen præsentation efterfulgt af mus immunisering er for nylig blevet offentliggjort14 . Derudover er det også blevet påvist, at disse formuleringer kunne omgå et af nanomedicinformuleringernes vigtigste flaskehalstrin: muligheden for at frysetørre dem uden at miste deres funktionalitet, hvilket muliggør langsigtet stabilitet i bløde tørre miljøer15.
I den forbindelse er formålet med den nuværende protokol at stille proceduren for dannelse af mRNA-nanopartiklerne til rådighed for det videnskabelige samfund ved at give en beskrivelse af de kritiske trin i protokollen og muliggøre produktion af effektive vacciner til forebyggelse af smitsomme sygdomme og anvendelse af tumorbehandling.
Følgende protokol beskriver den komplette træning for at syntetisere oligopeptid end-modificeret poly (beta aminoesters) – OM-pBAE polymerer, der yderligere vil blive brugt til nanopartikler syntese. I protokollen er nanopartikler formulering også inkluderet. Derudover er der også kritiske skridt til succes for proceduren og repræsentative resultater for at sikre, at de resulterende formuleringer udfører de nødvendige kvalitetskontrolkarakteriseringsfunktioner for at definere et positivt eller negativt resultat. Denne protokol er opsummeret i figur 1.
Efter udbruddet af Covid-19-pandemien sidste år har vaccinernes betydning i form af infektionssygdomsbekæmpelse manifesteret sig som en kritisk komponent8. Bestræbelser fra forskere verden over har gjort det muligt at frigive mange vacciner til markedet. For første gang i historien har mRNA-vacciner demonstreret deres tidligere hypotese succes takket være deres hurtige design på grund af deres evne til at tilpasse sig ethvert nyt antigen inden for nogle måneder5…
The authors have nothing to disclose.
Finansiel støtte fra MINECO/FEDER (tilskud SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 og COV20/01100) anerkendes. CGF anerkendte hendes IQS Ph.d.-stipendium.
1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
Acetone | Panreac | 141007 | |
CD11b antibody | BD | 550993 | |
CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
Equipment | |||
Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
Software | |||
NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |