Her presenteres en enkel protokoll for å produsere mRNA nanopartikler basert på poly (beta aminoester) polymerer, lett å bli skreddersydd ved å endre den innkapslede mRNA. Arbeidsflyten for å syntetisere polymerene, nanopartiklene og deres in vitro essensielle karakterisering er også beskrevet. Det legges også til et konseptbevis om immunisering.
Vaksinasjon har vært en av de største suksessene i det moderne samfunnet og er uunnværlig for å kontrollere og forebygge sykdom. Tradisjonelle vaksiner var sammensatt av hele eller brøkdeler av det smittsomme middelet. Utfordringene gjenstår imidlertid, og nye vaksineteknologier er obligatoriske. I denne sammenhengen har bruk av mRNA til immuniseringsformål vist en forbedret ytelse, som vist ved rask godkjenning av to mRNA-vaksiner som forhindrer SARS-CoV-2-infeksjon. Utover suksess med å forebygge virusinfeksjoner, kan mRNA-vaksiner også brukes til terapeutiske kreftapplikasjoner.
Likevel gjør ustabiliteten til mRNA og dens raske klaring fra kroppen på grunn av tilstedeværelsen av nukleaser sin nakne levering ikke mulig. I denne sammenhengen er nanomedisiner, og spesielt polymere nanopartikler, kritiske mRNA-leveringssystemer. Dermed er målet med denne artikkelen å beskrive protokollen for formulering og test av en mRNA-vaksinekandidat basert på de proprietære polymere nanopartiklene. Syntesen og kjemisk karakterisering av poly(beta aminoesters) polymerer som brukes, deres hudfarge med mRNA for å danne nanopartikler, og deres lyofiliseringsmetodikk vil bli diskutert her. Dette er et avgjørende skritt for å redusere lagrings- og distribusjonskostnader. Til slutt vil de nødvendige testene for å demonstrere deres evne til in vitro transfekt og modne modell dendrittiske celler bli indikert. Denne protokollen vil være til nytte for det vitenskapelige samfunnet som jobber med vaksinasjon på grunn av sin høye allsidighet som gjør det mulig for disse vaksinene å forebygge eller kurere et bredt spekter av sykdommer.
Smittsomme sykdommer har representert en alvorlig trussel mot millioner av mennesker over hele verden og er fortsatt en av de ledende dødsårsakene i noen utviklingsland. Profylaktisk vaksinasjon har vært en av de mest effektive intervensjonene i det moderne samfunnet for å forebygge og kontrollere smittsomme sykdommer1,2. Disse kritiske milepælene i vitenskapen i1900-talletsrelevans har blitt bemerket av den nylige verdensomspennende Covid-19-pandemien forårsaket av SARS-CoV-2-viruset3. Ved å erkjenne viktigheten av å ha effektive vaksiner for å begrense spredningen av sykdommen, har samarbeidsinnsats fra alle biomedisinske samfunn med hell resultert i mange profylaktiske vaksiner i markedet på mindre enn et år4.
Tradisjonelt var vaksiner sammensatt av svekkede (levende, redusert virulens) eller inaktiverte (dødspartikler) virus. Men for noen sykdommer uten margin for sikkerhetsfeil er virale partikler ikke mulig, og proteinunderenheter brukes i stedet. Likevel aktiverer underenheter vanligvis ikke kombinasjonen av mer enn en epitop / antigen, og adjuvanser er pålagt å forbedre vaksinasjonsstyrken5,6. Derfor står behovet for nye vaksinetyper klart.
Som demonstrert under den nåværende pandemien, kan nye vaksinekandidater basert på nukleinsyrer være fordelaktige når det gjelder å unngå lange utviklingsprosesser og gi høy allsidighet samtidig som de produserer en viktig pasientimmunisering. Dette er tilfelle av mRNA-vaksiner, som opprinnelig ble designet som eksperimentelle kreftvaksiner. Takket være deres naturlige kapasitet til å produsere antigenspesifikke T-celleresponser3,5,6,7. Å være mRNA molekylet som koder det antigene proteinet, bare endre det samme, vaksinen kan raskt skreddersys for å immunisere andre varianter av samme mikroorganisme, forskjellige stammer, andre smittsomme mikroorganismer, eller til og med bli en kreftimmunoterapeutisk behandling. I tillegg er de fordelaktige når det gjelder store produksjonskostnader. Imidlertid har mRNA et betydelig hinder som hemmer deres nakne administrasjon: stabiliteten og integriteten er kompromittert i fysiologiske medier, fulle av nukleaser. Av denne grunn er bruk av en nanometrisk bærer som beskytter den og vektoriserer mRNA til de antigen-presenterende cellene nødvendig2,8.
I denne sammenhengen er poly (beta aminoestere) (pBAE) en klasse biokompatible og biologisk nedbrytbare polymerer som viste en bemerkelsesverdig evne til å komplekse mRNA i nanometriske partikler, takket være deres kationiske ladninger9,10,11. Disse polymerene består av esterbindinger, noe som gjør deres nedbrytning lett av esteraser i fysiologiske forhold. Blant pBAE-bibliotekkandidatene viste de som var funksjonalisert med end kationiske oligopeptider en høyere kapasitet til å danne små nanopartikler for effektivt å trenge inn i celler gjennom endokytose og transfektere det innkapslede genmaterialet. Videre, takket være deres bufferkapasitet, tillater forsuring av endosome rommet endosomal flukt12,13. Nemlig en bestemt type pBAE, inkludert hydrofobe moieties på ryggraden (den såkalte C6 pBAE) for å forbedre deres stabilitet og end-oligopeptid kombinasjon (60% av polymer modifisert med en tri-lysin og 40% av polymeren med en tri-histidin) som selektivt transfekter antigen-presenting celler etter parenteral administrasjon og produsere mRNA kodet antigen presentasjon etterfulgt av mus immunisering har nylig blitt publisert14 . I tillegg har det også blitt demonstrert at disse formuleringene kan omgå et av de viktigste flaskehalstrinnene i nanomedisinske formuleringer: muligheten til å fryse tørk dem uten å miste funksjonaliteten, noe som muliggjør langsiktig stabilitet i myke tørre miljøer15.
I denne sammenhengen er målet med den nåværende protokollen å gjøre prosedyren for dannelsen av mRNA nanopartikler tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet ved å gi en beskrivelse av de kritiske trinnene i protokollen og muliggjøre produksjon av effektive vaksiner for smittsomme sykdommer forebygging og tumorbehandlingsapplikasjoner.
Følgende protokoll beskriver den komplette treningsøkten for å syntetisere oligopeptid endmodifisert poly (beta aminoesters) – OM-pBAE polymerer som vil bli ytterligere brukt til nanopartikkelsyntese. I protokollen er nanopartikler formulering også inkludert. I tillegg er det også gitt kritiske trinn for å lykkes med prosedyren og representative resultater for å sikre at de resulterende formuleringene oppnår de nødvendige karakteriseringsfunksjonene for kvalitetskontroll for å definere et positivt eller negativt resultat. Denne protokollen er oppsummert i figur 1.
Etter utbruddet av Covid-19-pandemien i fjor, har betydningen av vaksiner når det gjelder smittsom sykdomskontroll manifestert seg som en kritisk komponent8. Innsats fra forskere over hele verden har gjort det mulig å frigjøre til markedet for mange vaksiner. For første gang i historien har mRNA-vaksiner vist sin tidligere hypoteiserte suksess, takket være deres raske design på grunn av deres evne til å tilpasse seg ethvert nytt antigen innen noen måneder5,</su…
The authors have nothing to disclose.
Økonomisk støtte fra MINECO/FEDER (tilskudd SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 og COV20/01100) er anerkjent. CGF anerkjente hennes IQS PhD Fellowship.
1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
Acetone | Panreac | 141007 | |
CD11b antibody | BD | 550993 | |
CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
Equipment | |||
Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
Software | |||
NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |