High-throughput, robuuste en zeer tijdflexibele methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden
Summary
Een high-throughput protocol voor de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) zaden wordt geleverd, waarbij de vloeistofbehandelingsstappen worden geoptimaliseerd met een eenvoudig zuigapparaat dat is gebouwd met een vacuümpomp. Honderden zaadmonsters kunnen op één dag aan de oppervlakte worden gesteriliseerd.
Abstract
Arabidopsis is veruit de plantenmodelsoort die het meest wordt gebruikt voor functionele studies. De oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden is een fundamentele stap die nodig is om dit doel te bereiken. Het is dus van het grootste belang om arabidopsis-zaadoppervlaksterilisatiemethoden met hoge doorvoer vast te stellen om tientallen tot honderden monsters (bijv. Transgene lijnen, ecotypen of mutanten) tegelijk te verwerken. Een sterilisatiemethode voor zaadoppervlakken op basis van de efficiënte eliminatie van vloeistof in buizen met een zelfgemaakte zuiginrichting die is opgebouwd uit een gemeenschappelijke vacuümpomp, wordt in deze studie gepresenteerd. Door de arbeidsintensieve hands-on tijd drastisch te verminderen met deze methode is het verwerken van enkele honderden monsters op één dag mogelijk met weinig moeite. Serie-tijdsverloopanalyses wezen verder op een zeer flexibel tijdsbereik van oppervlaktesterilisatie door hoge kiemsnelheden te handhaven. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor oppervlaktesterilisatie van andere soorten kleine zaden met eenvoudige aanpassing van het zuigapparaat op basis van de zaadgrootte en de gewenste snelheid om de vloeistof te elimineren.
Introduction
Arabidopsis is een diploïde plantensoort uit de familie Brassicaceae. De relatief korte levenscyclus (twee maanden per generatie onder lange dag groeiomstandigheden), kleine plantgrootte en zelfbestuiving met de productie van honderden zaden per plant hebben het de eerste fundamentele plantmodelsoortgemaakt 1,2. Bovendien was het genoom volledig gesequenced3,uitgebreide reverse genetica-instrumenten (verzadigd T-DNA, transposon en chemisch gemuteerde populaties) zijn beschikbaar4,5,6,en effectieve Agrobacterium-gemedieerdetransformatie is goed ingeburgerd om voldoende transgene lijnen te verkrijgen voor verder stroomafwaarts werk7 . Zo zijn er in de afgelopen twee decennia grote vorderingen gemaakt met arabidopsis als modelsoort om verschillende aspecten van de plantenbiologie op moleculair niveau te ontleden, waaronder natuurlijke, genetische en fenotypische variatie8,9.
Om genen van belang in Arabidopsis functioneel te karakteriseren, is sterilisatie van het zaadoppervlak om schimmel- en bacteriële verontreinigingen te elimineren de vereiste stap voor veel stroomafwaartse protocollen die axeenculturen vereisen. Genetische transformatie voor de overexpressie10, knock-down (RNA-I11) of knock-out (genoombewerking12,13) van genfunctie, subcellulaire lokalisatie14, promotoractiviteit15,16, eiwit-eiwit17 en eiwit-DNA-interactie18, om alleen de meest voorkomende toepassingen te noemen, vereisen allemaal een sterilisatiestap voor het zaadoppervlak. Ondanks de relatieve eenvoud speelt sterilisatie van het zaadoppervlak dus een fundamentele rol in veel functionele analyses.
Tot nu toe zijn twee belangrijke categorieën sterilisatiemethoden voor zaadoppervlakken ontwikkeld op basis van gas- of vloeistoffasesterilisatie19. Hoewel de doorvoer van gasfase zaadoppervlaksterilisatie gemiddeld tot hoog is, heeft het gebruik van het gevaarlijke reagens chloorgas als oppervlaktesterilisatiemiddel de brede toepassing ervan belemmerd. Methoden op basis van vloeistoffasesterilisatie vertrouwen daarentegen op mildere chemicaliën zoals ethanol en bleekoplossingen voor oppervlaktesterilisatie, en ze worden op grotere schaal gebruikt ondanks dat ze een inherent lagere doorvoer hebben dan chloorontsmetting. Over het algemeen worden vaak twee verschillende methoden gebruikt die vloeibare reagentia gebruiken. Een veel gebruikte methode is gebaseerd op wassen met ethanol en bleekmiddel in verschillende concentraties gedurende verschillende tijdsduur20,21. Een andere methode is gebaseerd op de toepassing van bleekmiddel slechts21,22. Beide methoden worden voornamelijk toegepast voor kleinschalige sterilisatie van zaadoppervlakken. In veel experimenten is het echter noodzakelijk om veel Arabidopsis transgene lijnen afgeleid van één transformatie15,23 te screenen of parallel veel transgene lijnen te screenen die zijn gegenereerd uit verschillende transformaties24,25. Voor zover wij weten, is er geen op vloeistof gebaseerde methode voor sterilisatie van zaadoppervlakken met hoge doorvoer gepubliceerd, wat, hoewel weinig erkend, een belangrijk knelpunt vormt voor functionele genomica-benaderingen. Daarom is het ontwikkelen van veilige, robuuste en high-throughput methoden voor sterilisatie van zaadoppervlakken een noodzakelijke en kritieke stap naar het succes van de functionele karakterisering van veel genen tegelijk.
Hiertoe wordt in de huidige studie een verbeterde methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden gepresenteerd. Deze methode is veilig, goedkoop, zeer robuust en met een hoge doorvoer, waardoor 96 onafhankelijke lijnen binnen een uur vanaf het begin van de sterilisatie van het zaadoppervlak tot het einde van het zaaien in petrischalen kunnen worden verwerkt. De gedemonstreerde methode is gebaseerd op algemeen beschikbare, elementaire laboratoriuminstrumenten zoals een vacuümpomp, consumeerbaar glaswerk en plastic waren. Deze verbeterde methode biedt de wetenschappelijke gemeenschap een veilige, eenvoudige en betaalbare aanpak om de sterilisatie van zaadoppervlakken te stroomlijnen met een doorvoer die voldoende is voor moderne functionele genomica-benaderingen in Arabidopsis en andere niet-modelplantensoorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sterilisatie van zaden is de fundamentele stap voor functionele studies in Arabidopsis. Hoewel het vaak voor veel verschillende doeleinden wordt uitgevoerd, zijn er beperkte studies beschikbaar over sterilisatie van zaadoppervlakken met hoge doorvoer in Arabidopsis.
Tot nu toe is een van de methoden met de hoogste doorvoer het gebruik van chloorgas dat wordt gegenereerd door bleekmiddel te mengen met geconcentreerd HCl. Hoewel deze methode beperkte hands-on tijd vereist, gebruikt het een gas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de autonome provincie Trento door middel van kernfinanciering van de Ecogenomics-groep van Fondazione E. Mach.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
References
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
