Método de alto rendimiento, robusto y altamente flexible en el tiempo para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis
Summary
Se proporciona un protocolo de alto rendimiento para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optimizando los pasos de manejo de líquidos con un dispositivo de succión simple construido con una bomba de vacío. Cientos de muestras de semillas pueden ser esterilizadas superficialmente en un día.
Abstract
Arabidopsis es, con mucho, la especie modelo de planta más utilizada para estudios funcionales. La esterilización superficial de las semillas de Arabidopsis es un paso fundamental requerido para este fin. Por lo tanto, es primordial establecer métodos de esterilización de la superficie de semillas de Arabidopsis de alto rendimiento para manejar decenas a cientos de muestras (por ejemplo, líneas transgénicas, ecotipos o mutantes) a la vez. En este estudio se presenta un método de esterilización de la superficie de la semilla basado en la eliminación eficiente de líquido en tubos con un dispositivo de succión casero construido a partir de una bomba de vacío común. Al reducir drásticamente el tiempo práctico intensivo en mano de obra con este método, es posible manejar varios cientos de muestras en un día con poco esfuerzo. Los análisis de series indicaron además un rango de tiempo altamente flexible de esterilización de superficies al mantener altas tasas de germinación. Este método podría adaptarse fácilmente para la esterilización superficial de otros tipos de semillas pequeñas con una simple personalización del dispositivo de succión de acuerdo con el tamaño de la semilla y la velocidad deseada para eliminar el líquido.
Introduction
Arabidopsis es una especie de planta diploide perteneciente a la familia Brassicaceae. Su ciclo de vida relativamente corto (dos meses por generación en condiciones de crecimiento de días largos), el pequeño tamaño de la planta y la autopolinización con la producción de cientos de semillas por planta la han convertido en la primera especie modelo de planta fundamental1,2. Además, su genoma fue completamente secuenciado3,extensas herramientas de genética inversa (ADN-T saturado, transposón y poblaciones químicamente mutagenizadas) están disponibles4,5,6,y la transformación efectiva mediada por Agrobacteriumestá bien establecida para obtener suficientes líneas transgénicas para futuros trabajos aguasabajo 7 . Así, durante las últimas dos décadas, se han logrado grandes avances utilizando Arabidopsis como especie modelo para diseccionar diversos aspectos de la biología vegetal a nivel molecular, incluyendo la variación natural, genética y fenotípica8,9.
Para caracterizar funcionalmente los genes de interés en Arabidopsis, la esterilización de la superficie de la semilla para eliminar los contaminantes fúngicos y bacterianos es el paso previo para muchos protocolos posteriores que requieren cultivos axénicos. La transformación genética para la sobreexpresión10,knock-down (ARN-I11)o knock-out (edición del genoma12,13)de la función génica, localización subcelular14,actividad promotora15,16,proteína-proteína17 e interacción proteína-ADN18,por citar solo las aplicaciones más comunes, todas requieren un paso de esterilización de la superficie de la semilla. Por lo tanto, a pesar de su relativa simplicidad, la esterilización de la superficie de la semilla juega un papel fundamental en muchos análisis funcionales.
Hasta ahora, se han desarrollado dos categorías principales de métodos de esterilización de la superficie de las semillas basados en la esterilización en fase gaseosa o líquida19. Si bien el rendimiento de la esterilización superficial de semillas en fase gaseosa es de medio a alto, el uso del peligroso reactivo gas cloro como agente de esterilización superficial ha obstaculizado su amplia aplicación. Los métodos basados en la esterilización en fase líquida, por el contrario, se basan en productos químicos más suaves como el etanol y las soluciones de lejía para la esterilización de superficies, y se utilizan más ampliamente a pesar de que tienen un rendimiento inherentemente menor que la fumigación con cloro. En general, se utilizan comúnmente dos métodos diferentes que utilizan reactivos líquidos. Un método muy utilizado se basa en el lavado con etanol y lejía a diferentes concentraciones durante diferentes períodos de tiempo20,21. Otro método se basa en la aplicación de lejía solo21,22. Ambos métodos se aplican principalmente para la esterilización de la superficie de semillas a pequeña escala. Sin embargo, en muchos experimentos, es necesario cribar muchas líneas transgénicas de Arabidopsis derivadas de una transformación15,23 o cribar en paralelo muchas líneas transgénicas generadas a partir de diferentes transformaciones24,25. Hasta donde sabemos, no se ha publicado ningún método a base de líquido para la esterilización de superficies de semillas de alto rendimiento, lo que constituye, aunque poco reconocido, un cuello de botella importante para los enfoques de genómica funcional. Por lo tanto, el desarrollo de métodos seguros, robustos y de alto rendimiento para la esterilización de la superficie de las semillas es un paso necesario y crítico hacia el éxito de la caracterización funcional de muchos genes a la vez.
Con este fin, en el estudio actual, se presenta un método mejorado para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis. Este método es seguro, de bajo costo, altamente robusto y de alto rendimiento, lo que permite manejar 96 líneas independientes dentro de una hora desde el comienzo de la esterilización de la superficie de la semilla hasta el final de la siembra de semillas en placas de Petri. El método demostrado se basa en instrumentación de laboratorio básica ampliamente disponible, como una bomba de vacío, cristalería consumible y artículos de plástico. Este método mejorado proporciona a la comunidad científica un enfoque seguro, simple y asequible para agilizar la esterilización de la superficie de las semillas con un rendimiento adecuado a los enfoques modernos de genómica funcional en Arabidopsis y otras especies de plantas no modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La esterilización de semillas es el paso fundamental para los estudios funcionales en Arabidopsis. Aunque con frecuencia se lleva a cabo para muchos propósitos diferentes, se dispone de estudios limitados sobre la esterilización de la superficie de semillas de alto rendimiento en Arabidopsis.
Hasta ahora, uno de los métodos con mayor rendimiento es el uso de gas cloro generado por la mezcla de lejía con HCl concentrado. Aunque este método requiere un tiempo práctico limitado, utiliza un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por la Provincia Autónoma de Trento a través de la financiación básica del grupo de Ecogenómica de la Fondazione E. Mach.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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