Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis
Summary
Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.
Abstract
Arabidopsis est de loin l’espèce modèle végétale la plus largement utilisée pour les études fonctionnelles. La stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis est une étape fondamentale nécessaire à cette fin. Ainsi, il est primordial d’établir des méthodes de stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis à haut débit pour traiter des dizaines à des centaines d’échantillons (par exemple, des lignées transgéniques, des écotypes ou des mutants) à la fois. Une méthode de stérilisation de la surface des graines basée sur l’élimination efficace du liquide dans les tubes avec un dispositif d’aspiration fait maison construit à partir d’une pompe à vide commune est présentée dans cette étude. En réduisant considérablement le temps de travail intensif avec cette méthode, il est possible de traiter plusieurs centaines d’échantillons en une journée avec peu d’effort. Les analyses chronologiques en série ont en outre indiqué une plage de temps très flexible de stérilisation de surface en maintenant des taux de germination élevés. Cette méthode pourrait être facilement adaptée à la stérilisation de surface d’autres types de petites graines avec une simple personnalisation du dispositif d’aspiration en fonction de la taille de la graine et de la vitesse souhaitée pour éliminer le liquide.
Introduction
Arabidopsis est une espèce de plante diploïde appartenant à la famille des Brassicaceae. Son cycle de vie relativement court (deux mois par génération dans des conditions de croissance de longue durée), sa petite taille de plante et son autopollinisation avec la production de centaines de graines par plante en ont fait la première espèce modèle végétale fondamentale1,2. De plus, son génome a été entièrement séquencé3,de vastes outils de génétique inverse (ADN-T saturé, transposon et populations chimiquement mutagénisées) sont disponibles4,5,6, et une transformation efficace médiée par Agrobacteriumest bien établie pour obtenir suffisamment de lignées transgéniques pour d’autres travaux en aval7 . Ainsi, au cours des deux dernières décennies, de grands progrès ont été réalisés en utilisant Arabidopsis comme espèce modèle pour disséquer divers aspects de la biologie végétale au niveau moléculaire, y compris la variation naturelle, génétique et phénotypique8,9.
Pour caractériser fonctionnellement les gènes d’intérêt pour Arabidopsis, la stérilisation de la surface des graines pour éliminer les contaminants fongiques et bactériens est l’étape préalable à de nombreux protocoles en aval nécessitant des cultures axeniques. La transformation génétique pour la surexpression10,le knock-down (ARN-I11)ou le knock-out (édition du génome12,13)de la fonction génique, la localisation subcellulaire14,l’activité promotrice15,16,l’interaction protéine-protéine17 et l’interaction protéine-ADN18,pour ne citer que les applications les plus courantes, nécessitent toutes une étape de stérilisation à la surface de la graine. Ainsi, malgré sa relative simplicité, la stérilisation de surface des semences joue un rôle fondamental dans de nombreuses analyses fonctionnelles.
Jusqu’à présent, deux grandes catégories de méthodes de stérilisation de surface des semences ont été développées sur la base de la stérilisation en phase gazeuse ou liquide19. Bien que le débit de stérilisation de surface des semences en phase gazeuse soit moyen à élevé, l’utilisation du réactif dangereux chlore gazeux comme agent de stérilisation de surface a entravé son application à grande échelle. Les méthodes basées sur la stérilisation en phase liquide, au contraire, reposent sur des produits chimiques plus doux comme l’éthanol et les solutions d’eau de Javel pour la stérilisation de surface, et elles sont plus largement utilisées malgré leur débit intrinsèquement inférieur à celui de la fumigation au chlore. En général, deux méthodes différentes qui utilisent des réactifs liquides sont couramment utilisées. Une méthode largement utilisée est basée sur le lavage à l’éthanol et à l’eau de Javel à différentes concentrations pour différentes durées de temps20,21. Une autre méthode est basée sur l’application d’eau de Javel seulement21,22. Les deux méthodes sont principalement appliquées pour la stérilisation de surface des semences à petite échelle. Cependant, dans de nombreuses expériences, il est nécessaire de dépister de nombreuses lignées transgéniques d’Arabidopsis dérivées d’une transformation15,23 ou de filtrer en parallèle de nombreuses lignées transgéniques générées à partir de différentes transformations24,25. À notre connaissance, aucune méthode à base de liquide pour la stérilisation de surface des semences à haut débit n’a été publiée, ce qui constitue, bien que peu reconnu, un goulot d’étranglement important pour les approches de génomique fonctionnelle. Par conséquent, le développement de méthodes sûres, robustes et à haut débit pour la stérilisation de la surface des semences est une étape nécessaire et critique vers le succès de la caractérisation fonctionnelle de nombreux gènes à la fois.
À cette fin, dans la présente étude, une méthode améliorée de stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis est présentée. Cette méthode est sûre, peu coûteuse, très robuste et à haut débit, permettant de traiter 96 lignes indépendantes en une heure à partir du début de la stérilisation de la surface des graines jusqu’à la fin du semis dans des boîtes de Pétri. La méthode démontrée repose sur des instruments de laboratoire de base largement disponibles, tels qu’une pompe à vide, de la verrerie consommable et des articles en plastique. Cette méthode améliorée fournit à la communauté scientifique une approche sûre, simple et abordable pour rationaliser la stérilisation de la surface des semences avec un débit adéquat aux approches génomiques fonctionnelles modernes chez Arabidopsis et d’autres espèces végétales non modèles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La stérilisation des graines est l’étape fondamentale des études fonctionnelles chez Arabidopsis. Bien qu’elle soit fréquemment réalisée à de nombreuses fins différentes, des études limitées sur la stérilisation de surface des semences à haut débit chez Arabidopsis sont disponibles.
Jusqu’à présent, l’une des méthodes avec le débit le plus élevé consiste à utiliser du chlore gazeux généré par le mélange d’eau de Javel avec du HCl concentré. Bien que cette mé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par la province autonome de Trente grâce au financement de base du groupe Ecogenomics de la Fondazione E. Mach.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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