Высокопроизводительный, надежный и гибкий по времени метод поверхностной стерилизации семян арабидопсиса
Summary
Предусмотрен высокопроизводительный протокол поверхностной стерилизации семян Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), оптимизирующий этапы обработки жидкости с помощью простого всасывающего устройства, построенного с вакуумным насосом. Сотни образцов семян могут быть стерилизованы поверхностно за один день.
Abstract
Arabidopsis на сегодняшний день является модельным видом растений, наиболее широко используемым для функциональных исследований. Поверхностная стерилизация семян арабидопсиса является фундаментальным шагом, необходимым для достижения этой цели. Таким образом, крайне важно установить высокопроизводительные методы поверхностной стерилизации семян Arabidopsis для обработки от десятков до сотен образцов (например, трансгенных линий, экотипов или мутантов) одновременно. В данном исследовании представлен метод стерилизации поверхности семян, основанный на эффективном устранении жидкости в трубах с помощью самодельного всасывающего устройства, построенного из общего вакуумного насоса. За счет резкого сокращения трудоемкого практического времени с помощью этого метода обработка нескольких сотен образцов за один день возможна с небольшими усилиями. Последовательные анализы времени также показали весьма гибкий диапазон времени поверхностной стерилизации за счет поддержания высоких показателей всхожести. Этот метод может быть легко адаптирован для поверхностной стерилизации других видов мелких семян с простой настройкой всасывающего устройства в соответствии с размером семян и скоростью, желаемой для устранения жидкости.
Introduction
Arabidopsis — вид диплоидных растений, относящийся к семейству Brassicaceae. Его относительно короткий жизненный цикл (два месяца на поколение в условиях долгого дня выращивания), небольшой размер растения и самоопыление с производством сотен семян на растение сделали его первым фундаментальным модельным видом растений1,2. Кроме того, его геном был полностью секвенирован3,обширные инструменты обратной генетики (насыщенные Т-ДНК, транспозоны и химически мутагенизированные популяции) доступны4,5,6, и эффективная Agrobacterium-опосредованная трансформация хорошо установлена для получения достаточных трансгенных линий для дальнейшей последующей работы7 . Таким образом, за последние два десятилетия были достигнуты большие успехи, используя Arabidopsis в качестве модельного вида для препарирования различных аспектов биологии растений на молекулярном уровне, включая естественные, генетические и фенотипические вариации8,9.
Чтобы функционально охарактеризовать гены, представляющие интерес для Arabidopsis, стерилизация поверхности семян для устранения грибковых и бактериальных загрязнителей является предварительным этапом для многих последующих протоколов, требующих аксеновых культур. Генетическая трансформация для сверхэкспрессии10,нокдауна (РНК-I11)или нокаута (редактирование генома12,13)функции гена, субклеточной локализации14,промоторной активности15,16,белка-белка17 и белково-ДНК-взаимодействия18,чтобы привести только наиболее распространенные применения, все это требует стадии стерилизации поверхности семян. Таким образом, несмотря на свою относительную простоту, стерилизация поверхности семян играет фундаментальную роль во многих функциональных анализах.
До настоящего времени были разработаны две основные категории методов поверхностной стерилизации семян, основанные либо на газофазной, либо на жидкофазной стерилизации19. В то время как пропускная способность газофазной поверхностной стерилизации семян является средней или высокой, использование опасного реагента газообразного хлора в качестве поверхностного стерилизующего агента препятствует его широкому применению. Методы, основанные на жидкофазной стерилизации, напротив, полагаются на более мягкие химические вещества, такие как этанол и отбеливающие растворы для поверхностной стерилизации, и они более широко используются, несмотря на то, что они имеют по своей сути более низкую пропускную способность, чем фумигация хлором. В общем, обычно используются два разных метода, в которых используются жидкие реагенты. Один из широко используемых методов основан на промывке этанолом и отбеливателем в разных концентрациях на разную продолжительностьвремени 20,21. Другой метод основан на нанесении отбеливателятолько 21,22. Оба метода в основном применяются для мелкомасштабной поверхностной стерилизации семян. Однако во многих экспериментах необходимо экранировать многие трансгенные линии Arabidopsis, полученные из одного преобразования15,23 или экранировать параллельно множество трансгенных линий, генерируемых из разных преобразований24,25. Насколько нам известно, не было опубликовано ни одного жидкого метода высокопроизводительной поверхностной стерилизации семян, который представляет собой, хотя и малопризнанный, важное узкое место для подходов функциональной геномики. Поэтому разработка безопасных, надежных и высокопроизводительных методов стерилизации поверхности семян является необходимым и критическим шагом на пути к успеху функциональной характеристики многих генов одновременно.
С этой целью в настоящем исследовании представлен усовершенствованный метод поверхностной стерилизации семян арабидопсиса. Этот метод является безопасным, недорогим, высокопрочным и высокопроизводительным, что позволяет обрабатывать 96 независимых линий в течение одного часа от начала стерилизации поверхности семян до конца посева семян в чашках Петри. Продемонстрированный метод опирается на широко доступные, базовые лабораторные приборы, такие как вакуумный насос, расходная стеклянная посуда и пластиковая посуда. Этот улучшенный метод предоставляет научному сообществу безопасный, простой и доступный подход к оптимизации стерилизации поверхности семян с пропускной способностью, адекватной современным подходам функциональной геномики у арабидопсиса и других немодельных видов растений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стерилизация семян является фундаментальным шагом для функциональных исследований при арабидопсисе. Хотя он часто проводится для многих различных целей, доступны ограниченные исследования по высокопроизводительной стерилизации поверхности семян при арабидопсисе.
Д?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось автономной провинцией Тренто через основное финансирование группы по экономике Fondazione E. Mach.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
References
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
