Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre
Summary
Nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine 43 de liaison à l’ADN TAR (TDP-43) par la lumière dans les motoneurones de la colonne vertébrale en utilisant le poisson-zèbre comme modèle.
Abstract
L’agrégation anormale des protéines et la vulnérabilité neuronale sélective sont deux caractéristiques majeures des maladies neurodégénératives. Les relations causales entre ces caractéristiques peuvent être interrogées en contrôlant la transition de phase d’une protéine associée à la maladie dans un type de cellule vulnérable, bien que cette approche expérimentale ait été limitée jusqu’à présent. Ici, nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine de liaison ARN/ADN TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre pour modéliser l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 se produisant dans les motoneurones en dégénérescence dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons une méthode génétique basée sur le chromosome artificiel bactérien (BAC) pour administrer une variante optogénétique du TDP-43 de manière sélective aux motoneurones spinaux du poisson-zèbre. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet la transition de phase du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux par un simple éclairage externe à l’aide d’une diode électroluminescente (LED) contre les poissons non retenus. Nous présentons également un flux de travail de base d’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et d’analyse d’images avec le logiciel Fiji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à l’éclairage lumineux. Ce protocole permet de caractériser la transition de phase du TDP-43 et la formation d’agrégats dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA, ce qui devrait faciliter l’étude de ses conséquences cellulaires et comportementales.
Introduction
Les granules de ribonucléoprotéines (RNP) contrôlent une myriade d’activités cellulaires dans le noyau et le cytoplasme en assemblant des partitions sans membrane via la séparation de phase liquide-liquide (LLPS), un phénomène dans lequel un fluide homogène se décompose en deux phases liquides distinctes1,2. Le LLPS dérégulé des protéines de liaison à l’ARN qui fonctionnent normalement comme des composants de granules RNP favorise une transition de phase anormale, conduisant à l’agrégation des protéines. Ce processus a été impliqué dans les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives3,4,5. L’évaluation précise d’une relation causale entre le LLPS aberrant des protéines de liaison à l’ARN et la pathogenèse de la maladie est cruciale pour déterminer si et comment le LLPS peut être exploité comme cible thérapeutique efficace. Le LLPS des protéines de liaison à l’ARN est relativement facile à étudier in vitro et dans des modèles unicellulaires, mais est difficile dans les organismes multicellulaires, en particulier chez les vertébrés. Une exigence critique pour l’analyse d’un tel LLPS dans des cellules individuelles dans un environnement tissulaire est d’exprimer de manière stable une sonde pour l’imagerie et la manipulation du LLPS dans un type de cellule vulnérable à la maladie.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un trouble neurologique finalement mortel dans lequel les motoneurones du cerveau et de la moelle épinière sont perdus sélectivement et progressivement en raison de la dégénérescence. À ce jour, des mutations dans plus de 25 gènes ont été associées à la forme héréditaire (ou familiale) de la SLA, qui représente 5 % à 10 % du total des cas de SLA, et certains de ces gènes causant la SLA codent pour des protéines de liaison à l’ARN constituées de RNI, telles que hnRNPA1, TDP-43 et FUS6,7. De plus, la forme sporadique de la SLA, qui représente 90% à 95% du total des cas de SLA, est caractérisée par l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 déposée dans les motoneurones en dégénérescence. Une caractéristique majeure de ces protéines de liaison à l’ARN associées à la SLA est leurs régions intrinsèquement désordonnées (IDR) ou domaines de faible complexité qui manquent de structures tridimensionnelles ordonnées et interviennent dans de faibles interactions protéine-protéine avec de nombreuses protéines différentes qui conduisent LLPS7,8. Le fait que des mutations causant la SLA se produisent souvent dans les IDR a conduit à l’idée que le LLP aberrant et la transition de phase de ces protéines liées à la SLA peuvent sous-tendre la pathogenèse de la SLA9,10.
Récemment, la méthode optoDroplet, une technique optogénétique basée sur Cryptochrome 2 qui permet la modulation des interactions protéine-protéine par la lumière, a été développée pour induire la transition de phase des protéines avec IDRs11. Comme cette technique a été étendue avec succès au TDP-43, elle a commencé à découvrir les mécanismes sous-jacents à la transition de phase pathologique du TDP-43 et sa cytotoxicité associée12,13,14,15. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode génétique pour délivrer un TDP-43 optogénétique aux types de cellules vulnérables à la SLA, à savoir les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre en utilisant le BAC pour le gène mnr2b / mnx2b codant pour une protéine homéodomaine pour la spécification des motoneurones16,17. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet une stimulation lumineuse simple et non invasive du TDP-43 optogénétique qui déclenche sa transition de phase dans les motoneurones spinaux. Nous présentons également un flux de travail de base pour l’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et l’analyse d’images à l’aide du logiciel Fidji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à la stimulation lumineuse. Ces méthodes permettent d’étudier la transition de phase du TDP-43 dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA et devraient aider à explorer ses conséquences pathologiques aux niveaux cellulaire et comportemental.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’expression médiée par mnr2b-BAC de l’opTDP-43h et de l’EGFP-TDP-43z chez le poisson-zèbre offre une occasion unique d’imagerie en direct de la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux. La transparence optique des tissus corporels des larves de poisson zèbre permet la stimulation optogénétique simple et non invasive de l’opTDP-43h. Les comparaisons entre les motoneurones spinaux uniques au fil du temps ont démontré que l’oligomérisation dépendante de la lumière de l’opTD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) et JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
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