Summary
TAR DNA bağlayıcı protein 43'ün (TDP-43) zebra balıklarını model olarak kullanarak spinal motor nöronlarda ışıkla faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Anormal protein toplama ve seçici nöronal kırılganlık nörodejeneratif hastalıkların iki önemli özelliğidir. Bu deneysel yaklaşım şimdiye kadar sınırlı olmasına rağmen, bu özellikler arasındaki nedensel ilişkiler, hastalıkla ilişkili bir proteinin savunmasız bir hücre tipinde faz geçişini kontrol ederek sorgulanabilir. Burada, amyotrofik lateral sklerozda (ALS) dejenere motor nöronlarda meydana gelen TDP-43'ün sitoplazmik toplamasının modellenmesi için zebra balığı larvalarının spinal motor nöronlarında RNA/DNA bağlayıcı protein TDP-43'ün faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz. Zebra balıklarının spinal motor nöronlarına seçici olarak optogenetik bir TDP-43 varyantı sunmak için bakteriyel yapay kromozom (BAC) tabanlı bir genetik yöntem tarif ediyoruz. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, spinal motor nöronlarındaki optogenetik TDP-43'ün, sınırsız balıklara karşı ışık yayan bir diyot (LED) kullanarak basit bir dış aydınlatma ile faz geçişine izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık aydınlatmasına verdiği tepkileri karakterize etmek için zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntüleme ve görüntü analizinin temel bir iş akışını serbestçe kullanılabilen Fiji /ImageJ yazılımı ile sunuyoruz. Bu protokol, ALS'ye karşı savunmasız bir hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin ve agrega oluşumunun karakterize edilmesine olanak tanır ve bu da hücresel ve davranışsal sonuçlarının araştırılmasını kolaylaştırmalıdır.
Introduction
Ribonikleoprotein (RNP) granülleri, homojen bir sıvının iki ayrı sıvı fazına dönüştüğü bir fenomen olan sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) yoluyla membransız bölümleri birleştirerek çekirdek ve sitoplazmadaki sayısız hücresel aktiviteyi kontrol eder1,2. Normalde RNP granül bileşenleri olarak işlev görür rna bağlayıcı proteinlerin düzensiz LLPS'si anormal faz geçişini teşvik eder ve protein toplanmasına yol ederim. Bu süreç nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara bulaşmıştır3,4,5. RNA bağlayıcı proteinlerin sapkın LLPS'si ile hastalık patogenezinin nedensel ilişkisinin kesin olarak değerlendirilmesi, LLPS'nin etkili bir terapötik hedef olarak kullanılıp kullanılmayacağını ve nasıl kullanılabileceğini belirlemek için çok önemlidir. RNA bağlayıcı proteinlerin LLPS'lerinin in vitro ve tek hücreli modellerde çalışması nispeten kolaydır, ancak özellikle omurgalılarda çok hücreli organizmalarda zordur. Bu tür LLPS'leri doku ortamındaki bireysel hücrelerde analiz etmek için kritik bir gereklilik, hastalık açısından savunmasız bir hücre türünde LLPS'nin görüntülenmesi ve manipülasyonu için bir probun kesin olarak ifade etmesidir.
Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin ve omuriliğin motor nöronlarının dejenerasyon nedeniyle seçici ve aşamalı olarak kaybolduğu sonuçta ölümcül bir nörolojik bozukluktur. Bugüne kadar, 25'ten fazla gendeki mutasyonlar, toplam ALS vakalarının% 5-10'unu oluşturan ALS'nin kalıtsal (veya ailesel) formu ile ilişkilendirilmiştir ve bu ALS nedenli genlerden bazıları hnRNPA1, TDP-43 ve FUS6,7 gibi RNP'lerden oluşan RNA bağlayıcı proteinleri kodlamaktadır. Ayrıca, toplam ALS vakalarının% 90-95'ini oluşturan ALS'nin sporadik formu, dejenere motor nöronlarda biriken TDP-43'ün sitoplazmik toplanması ile karakterizedir. Bu ALS ilişkili RNA bağlayıcı proteinlerin önemli bir özelliği, sıralı üç boyutlu yapılardan yoksun ve LLPS7,8'i yönlendiren birçok farklı proteinle zayıf protein-protein etkileşimlerine aracılık eden özünde düzensiz bölgeleri (IDR'ler) veya düşük karmaşıklık alan adlarıdır. ALS'ye neden olan mutasyonların genellikle IDR'lerde meydana gelmesi, ALS ile ilişkili bu proteinlerin anormal LLPS ve faz geçişinin ALS patogenezinin altında yatan olabileceği fikrine yol açmıştır9,10.
Son zamanlarda, protein-protein etkileşimlerinin ışıkla modülasyonunu sağlayan Cryptochrome 2 tabanlı bir optogenetik teknik olan optoDroplet yöntemi, proteinlerin IDRs11 ile faz geçişini teşvik etmek için geliştirilmiştir. Bu teknik başarıyla TDP-43'e genişletildikçe, TDP-43'ün patolojik faz geçişinin altında kalan mekanizmaları ve buna bağlı sitotoksikliğini ortaya çıkarmaya başlamıştır12,13,14,15. Bu protokolde, ALS'ye karşı savunmasız hücre tiplerine optogenetik bir TDP-43, yani motor nöron spesifikasyonu için bir homeodomain proteinini kodlayan mnr2b/mnx2b gen kodlaması için BAC kullanan zebra balıklarındaki spinal motor nöronları sunmak için genetik bir yöntem özetliyoruz16,17. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, omurilik motoru nöronlarında faz geçişini tetikleyen optogenetik TDP-43'ün basit, noninvaziv ışık stimülasyonuna izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık stimülasyonuna verdiği tepkileri karakterize etmek için serbestçe kullanılabilen Fiji/ImageJ yazılımını kullanarak zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntülenmesi ve görüntü analizi için temel bir iş akışı sunuyoruz. Bu yöntemler, ALS'ye açık hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin araştırılmasına izin verir ve patolojik sonuçlarını hücresel ve davranışsal düzeyde keşfetmeye yardımcı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm balık çalışmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi'nde (NIH, A5561-01 güvence numarası) bulunan Ulusal Genetik Enstitüsü'nün (Japonya) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (onay kimlik numarası 24-2) uyarınca gerçekleştirildi. ABD).
1. mnr2b promotöründen optogenetik TDP-43 geninin ekspresyasyonu için BAC'lerin yapımı
- BAC hazırlığı
- Zebra balığı mnr2b locus (CH211-172N16, BACPAC Genomik) içeren bir zebra balığı BAC klonu satın alın. BAC DNA'sını, Isınma ve ark.18'de açıklandığı gibi CH211-172N16'yı barındıran DH10B Escherichia coli (E. coli) 5 mL gecelik LB kültüründen arındırın.
- CH211-172N16'yı, Warming ve ark.18'de açıklandığı gibi elektroporasyonla SW102 E. coli hücrelerine dönüştürün.
NOT: Bac DNA'sının aynı elektroporasyon gününde E. coli'den arındırılması genellikle BAC dönüşümünün daha yüksek bir başarı oranı sağlar18. Aksi takdirde, saflaştırılmış BAC DNA'sı kullanıma kadar -20 °C'de tutulur. - Tol2 transpozon aracılı BAC transgenesis19 için iTol2-amp kasetini, Asakawa ve ark.20'de açıklandığı gibi elektroporasyonla CH211-172N16'nın omurgasına sokun.
- E'nin gliserol stoğunu yap. polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) (Ex Taq) ile homolog rekombinasyon aracılı entegrasyonu onayladıktan sonra iTol2-amp kaset entegrasyonu (CH211-172N16-iTol2A) ile CH211-172N16 taşıyan coli hücre klonları astar çifti Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') ve pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') ve aşağıdaki koşulları kullanarak: 1 dakika boyunca 98 °C'de bir denatürasyon adımı, ardından 10 s için 95 °C'de 25 denatürasyon döngüsü, 15 s için 55 °C'de astar tavlama ve 1 dakika için 72 °C'de astar uzatma, 354 baz çift (bp) PCR ürününü güçlendirin.
- mnr2b-hs:opTDP-43h yapı
- Sırasıyla N ve C-termini'de mRFP1 ve CRY2olig ile etiketlenmiş insan vahşi tipi TDP-43/TARDBP (TDP-43h) için ifade kasetini taşıyan bir plazmid oluşturun (bundan sonra opTDP-43h)14.
NOT: opTDP-43h parçası zebra balığı hsp70l gen promotör dizisi (650 bp) ve poliadenilasyon (polyA) sinyal dizisi ile kuşatılmalı ve ardından kanamycin direnç geni (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14. - Hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini hsp70l ve Kan'ı tavlayan astarlarla güçlendirin ve mnr2b geninin başlatıcı kodonlarının yukarı ve aşağı akışlarının 45 bp dizilerini astar çifti mnr2 kullanarak PCR (GXL DNA Polymerase) ile güçlendirinb-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') ve Km-r (5'-ggt tct tca tca tca aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') aşağıdaki koşullarla: 1 dakika boyunca 98 °C'de bir denatürasyon adımı, ardından 10 s için 95 °C'de 30 denatürasyon döngüsü, 15 s için 55 °C'de astar tavlama ve 30 sn için 68 °C'de astar uzatma, ~5.7 bp'lik bir PCR ürününün yükseltülme.
- PCR ürünlerini agarose jel elektroforezi (100 V) ile ayırın ve hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA bandını bir DNA sütunu ile arındırın. Saflaştırılmış hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetinin konsantrasyonu, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 mM EDTA içeren Tris-EDTA tamponunda (TE) 50 ng/μL'ye ayarlayın.
- Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini, Isınma ve ark.18'de açıklandığı gibi elektroporasyonla CH211-172N16-iTol2A'ya sokun ve LB agar plakalarında ampisiline ve kanamsin dirençli transformantları seçin. Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini taşıyan CH211-172N16-iTol2A, mnr2b-hs:opTDP-43h olarak belirlenmiştir.
- Mnr2b-hs:opTDP-43h'yi bir BAC arıtma kiti kullanarak arındırın ve fenol/kloroform ekstraksiyonu sonrası TE'de 250 ng/μL'de çözün.
- Sırasıyla N ve C-termini'de mRFP1 ve CRY2olig ile etiketlenmiş insan vahşi tipi TDP-43/TARDBP (TDP-43h) için ifade kasetini taşıyan bir plazmid oluşturun (bundan sonra opTDP-43h)14.
- mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z yapı
- OpTDP yerine N-terminusunda (EGFP-TDP-43z) gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş zebra balığı vahşi tip tardbp taşıyan başka bir plazmid inşa edin -43h ancak aksi takdirde hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan yapısı (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14 ile aynıdır. OPTDP-43h'nin ışık stimülasyonu için iç kontrol olarak EGFP-TDP-43z kullanın.
- 1.2.1-1.2.5'te açıklandığı gibi mnr2b lokustaki hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kasetini barındıran CH211-172N16-iTol2A oluşturun. Hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kasetini taşıyan CH211-172N16-iTol2A, mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z olarak belirlenmiştir.
2. Zebra balıklarında Tol2 transpoz aracılı BAC transgenez
- 40 mM KCl, fenol kırmızısı (%10 v/v), mnr2b-hs:opTDP-43h DNA'nın 25 ng/μL'si ve 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19 içeren enjeksiyon solüsyonunu hazırlayın.
- Enjeksiyon çözeltisinin 1 nL'sini (mineral yağda kalibre edilmiş yaklaşık 123 μm çapında bir damlacık) tek hücreli aşamada vahşi tip zebra balığı embriyolarının sitosoluna enjekte edin. Enjekte edilen balıkları, omurilik motor nöronları da dahil olmak üzere çeşitli embriyonik dokularda kırmızı floresan protein (RFP) pozitif agregaların oluşumu için 2-3 gün sonra floresan stereomikroskop altında tarayın (dpf). RFP pozitif balığı yetişkinliğe yükseltin.
- 2.1 ve 2.2'de açıklandığı gibi mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA'sını enjekte edin. EGFP pozitif balıkları yetişkinliğe yükseltin.
- Birkaç ay sonra, F1 yavrularını elde etmek için standart 2 L çiftleşme kafeslerine cinsel olarak olgunlaşmış enjekte edilmiş balık ve yabani tip balıkları çiftler halinde koyun. Plan-Neofluar 5x/0.15 objektif lens ile donatılmış bir epifluoresans mikroskobu kullanarak omurilik motor kolonunda RFP (opTDP-43h) veya EGFP (EGFP-TDP-43z) floresan için 3 dpf'de F1 balıklarını tarayın. Tipik olarak, bir kurucu balık 10−20 enjekte edilen balıktan tanımlanır (germline bulaşma oranı% 5−10'dur).
- OpTDP-43h veya EGFP-TDP-43z ekspresyonunun yoğunluğu, kromozomal konum etkileri nedeniyle kurucu balıklar arasında değişebileceğinden, farklı kurucu balıklardan gelen birden fazla Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ve Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] kesici uçlarını izole edin ve karşılaştırın.
- Tg içeren yavrular elde etmek için Çapraz Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ve Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] balık hatları [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Mendelian oranında çift transgenik balık.
- Balığı 30 mL E3 tamponu (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, %10-5 Metilen Mavisi) ve melanogenez inhibe etmek için 8-10 saat döllenme sonrası (hpf) 0.003% (w/v) N-feniltiyiourea ekleyin.
- Plastik kabı 30 hpf'den sonra alüminyum folyo ile örtün.
3. Mavi ışık aydınlatması için LED hazırlanması
- Tablette/telefonda yüklü olan ilişkili uygulamayı kullanarak LED paneli açın. Bir spektrometrenin probunu 6 kuyu kabının boş bir kuyusuna koyun ve LED ışığını uygulama aracılığıyla ~456 nm'de zirve yapmak üzere dalga boyuna ayarlayın. Optik güç ölçerin optik sensörlerini boş kuyuya yerleştirin ve LED ışığının gücünü ayarlayın (~0,61 mW/cm2). LED ışık ayarı kaydedilebilir ve uygulamada alınabilir.
- Çanak/LED panel ayarını 28 °C'de inkübatöre tanıtın. Balıkların görüntülenmesi 48 hpf'den başlamadan önce bu adımı tamamla.
4. Optogenetik TDP-43'i ifade eden zebra balığı larvalarının görüntülenmesi
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı en az 47 hpf'den önce seçin, yukarıda açıklanan epifluoresans mikroskobu kurulumunu kullanarak spinal motor kolonunda RFP (opTDP-43h) veya EGFP (EGFP-TDP-43z) floresansına dayanmaktadır.
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı deforionat.
- 42 °C'de 250 μg/mL etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu içeren % 1 düşük erime sıcaklığında agarose önceden ısıtın.
- Kısaca Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] çift transgenik balık kısaca anestezi E3 tamponda 48 hpf Tricane konsantrasyonu içeren.
- Önceden ısıtılmış% 1 düşük erime sıcaklığında agarose'dan bir damla oda sıcaklığında cam taban kabına koyun. Cam tabaktaki kubbe şeklindeki agarose damlasının çapı 8-10 mm'dir.
- Pasteur pipet kullanarak, uyuşturulmuş balıkları cam taban kabındaki düşük erime sıcaklığındaki agarose ekleyin ve ardından birkaç kez pipetleyarak karıştırın. Balıkla birlikte agarose'a eklenen E3 tampon miktarını en aza indirin.
- Omuriliğin uygun bir yatay konumda olduğundan emin olmak için agarose katılaşması sırasında bir şırınga iğnesi kullanarak (tipik olarak ~ 1 dk) balığı yan tarafta tutun. Katılaşmadan sonra, kubbe şeklindeki agarose monteli balığın üzerine birkaç damla E3 tamponu koyun.
- Piksel başına 4,0 μs (piksel başına 12 bit), amaç için dilim başına 1,0 μm adım boyutu ve uyarılma/emisyon dalga boylarının bir kombinasyonunu kullanarak, sayısal diyafram açıklığı 1,00 olan 20x su daldırma objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskopla tarayarak omuriliğin seri konfokal z bölümlerini elde edin: Kanal 1) EGFP için 473/510 nm ve Kanal 2) mRFP1 için 559/583 nm.
NOT: Balığın ventral tarafındaki kloaka, zaman noktalarında omurga segmentlerinin (seviye 16-17) tanımlanmasına ve karşılaştırılmaya yardımcı olan referans olarak ilgi alanlarına (ROI) dahil edilir. - Görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz agarose'u bir şırınga iğnesi ile dikkatlice kırarak balıkları agarosedan çıkarın. Balığın agaroseya gömdülme süresini mümkün olduğunca kısa tutun, ancak agarose <30 dakika boyunca gömülmesi balığın canlılığını etkilemez.
5. OpTDP-43h-ekspresyon balıklarının mavi ışık yayan diyot (LED) ışığının alan aydınlatması ile ışık stimülasyonu
- Kuyuya 7,5 mL E3 tamponu ekleyin ve görüntülenmiş Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı kuyuya yerleştirin. Çanağı ve LED paneli bir ara parçayla (örneğin, beş slayt gözlüğü istiflenmiş olarak) 5 mm aralıklarla tutarak altı kuyulu tabağı LED panele yerleştirin.
- Mavi LED ışığını açın. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balıklardan bazılarını, unilluminated kontrol balıkları gerektiğinde alüminyum folyo ile kaplı ayrı bir altı kuyulu tabakta tutun (yani karanlık koşullarda)14.
- Aydınlatmadan sonra (örneğin, Şekil 3'te 72 hpf'de 24 saat boyunca), 4.3 - 4.9 adımlarını tekrarlayarak aydınlatılmış balığın omuriliğini görüntüleyin.
6. Spinal motor nöronlarda optogenetik TDP-43'ün sitoplazmik yer değiştirmesinin görselleştirilmesi
- Görüntü dosyasını, nih image tarafından geliştirilen ve https://imagej.net/Fiji/Downloads indirilebilen açık kaynaklı bir Java görüntü işleme programı olan ImageJ/Fiji21'de (Sürüm: 2.1.0/1.53c) açın.
- Odak düzlemleri arasında hareket etmek için Z kaydırma çubuğunu kullanın. Görüntü |'i tıklatarak birden çok dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturma Yığınlar | Z proje | Maksimum Yoğunluk ve ayar Omurilik motor kolonunun hemisegmentlerini kaplayan Başlangıç dilimi ve Durdurma dilimi.
- Görüntü |'na tıklayarak çok kanallı görüntüyü iki tek kanallı görüntüye bölün Renk | Kanalları Böl.
- Görüntü | tıklayarak sitoplazmik EGFP-TDP-43z'nin net bir şekilde görülebilmesini sağlamak için EGFP-TDP-43z sinyalini geliştirin | ayarlama Parlaklık/Kontrast ve Minimum ayarlama
- Analiz |'ni tıklatarak yatırım getirisi yöneticisini açın Araçlar | Yatırım getirisi yöneticisi. Hücre gövdelerinin göreli konumlarına göre, her iki görüntüde de tanımlanabilen hücreleri 48 hpf ve 72 hpf olarak bulun. Freehand seçimlerini kullanarak EGFP-TDP-43z sinyali tarafından görselleştirilen tek spinal motor nöronlarının hücre gövdelerinin hatlarını özetleyerek ve ardından yatırım getirisi yöneticisinde Ekle[t] öğesini tıklatarak ROI'leri ayarlayın.
- Düz'ü kullanarak düz bir çizgi çizerek ve Analiz |'nı tıklatarak somanın ana eksenini ayarlayın EGFP-TDP-43z (C1) ve opTDP-43h (C2) görüntüleri için 48 ve 72 hpf'de Çizim Profili.
- Değerleri her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h sinyali için en büyük değere bölerek Çizim Profilini normalleştirin. X ve y'nin istatistiksel bir yazılımda XY grafiğini kullanarak sırasıyla soma ve göreli floresan yoğunluklarının ana eksenini temsil ettiği x-y koordinatlarıyla normalleştirilmiş değerleri çizin.
7. ImageJ/Fiji kullanarak opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyalleri arasında oranmetrik karşılaştırma
- ImageJ/Fiji'de görüntü dosyasını açın ve EGFP-TDP-43z'nin 6.1-6.5'teki gibi maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsünü kullanarak tek mnr2b pozitif hücreler için ROI'leri ayarlayın. Arka plan sinyalini (arka plan yatırım getirisi) temsil etmek için ventral omuriliğin (örneğin, notochord) dışına bir yatırım getirisi ekleyin.
- Her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43 görüntüsü için Görüntü | Yığınlar | Z proje | Dilimleri Topla ve Hemispinal motor sütununu kaplayan Başlangıç dilimini ve Durdur dilimini ayarlayın.
- Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsüyle oluşturulan yatırım getirisi yöneticisini açın. EGFP-TDP-43z için görüntü penceresini seçip yatırım getirisi yöneticisinde Tümü Göster'i tıklatarak RoI'leri Toplam Dilimler görüntüsünde görüntüleyin. Her yatırım getirisi için ortalama değerler elde etmek üzere yatırım getirisi yöneticisinde Ölçül'ü tıklatın.
- 7.3'te sağlanan aynı yordamı izleyerek opTDP-43h için ortalama değerler elde edin.
- Her yatırım getirisi için, arka plan yatırım getirisi için ortalamayı çıkardıktan sonra, opTDP-43h için çıkarılan ortalamayı, ORANSAL DEĞERI ELDE ETMEK İçİn EGFP-TDP-43z için çıkarılan ortalamaya bölün. Oranmetrik değerler farklı zaman noktaları arasında karşılaştırılabilir ve Prizma yazılımında Sütun grafiği kullanılarak sunulabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zebra balığı larvalarının mnr2b+ spinal motor nöronlarında optogenetik ve optogenetik olmayan TDP-43 proteinlerinin canlı görüntülenmesi
Zebra balıklarındaki spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişini teşvik etmek için, sırasıyla N ve C-termini'nde mRFP1 ve CRY2olig22 ile etiketlenmiş bir insan TDP-43h inşa edildi ve opTDP-43h14 olarak belirlendi (Şekil 1A). opTDP-43h gen parçası mnr2b lokusu içeren bir BAC'ye sokuldu (Şekil 1B). Mnr2b-hs:opTDP-43h olarak belirlenen sonuç BAC, Tol2 transposon aracılı BAC transgenesis19 tarafından zebra balığı genomuna sokuldu. Spinal motor nöronlarda optogenetik olmayan TDP-43'ün lokalizasyonunu izlemek, tardbp geni ile kodlanmış bir zebra balığı TDP-43, N-terminusta EGFP ile etiketlenmiştir (Şekil 1A) ve EGFP-TDP-43z gen parçası opTDP-43h'ye benzer şekilde mnr2b BAC'ye sokulmuşsa (Şekil 1B). Mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z olarak belirlenen sonuç BAC, Tol2 transposon aracılı BAC transgenez tarafından zebra balığı genomuna sokuldu. Her BAC yapısına enjekte edilen balıklar vahşi tip bir balıkla geçti ve elde edilen F1 balıkları 3. günde ventral omurilikte kırmızı (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) veya yeşil (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) floresan için tarandı. İzole kırmızı veya yeşil floresan pozitif F1 balığı sırasıyla Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] veya Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] olarak belirlenmiştir.
Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 48 hpf'deki çift transgenik balık uyuşturuldu ve yanlarında düşük erime agarose içine gömüldü; agarose katılaşmadan sonra, omuriliğin yan tarafının yukarıdan gözlemlenmesine izin vermek için E3 tamponu ile kaplandılar. Konfokal lazer tarama mikroskopisi 20x su daldırma objektif lensi ve ekscitasyon/emisyon dalga boylarının bir kombinasyonu ile gerçekleştirildi: EGFP için 473/510 nm ve mRFP1 için 559/583 nm. Taranan balık agazozdan hemen ve dikkatlice alındı, altı kuyulu bir plakada E3 tamponuna aktarıldı ve plaka 28 °C'de bir LED panele yerleştirilerek mavi bir LED ışıkla aydınlatıldı (Şekil 2A, B). 24 saat aydınlatmadan sonra, balık uyuşturuldu ve aynı görüntüleme koşulları kullanılarak konfokal mikroskopi ile taranmadan önce tekrar agarose içine gömüldü, ancak yatırım getirisi 48 hpf'de görüntülenen ilgili omurilik bölgesini içerecek şekilde ayarlandı (Şekil 2B). 4-5 bitişik omurilik segmentinin tüm hemispinal kordonu, konfokal tarama düzlemine göre atlı balığın omuriliğinin boyuna ekseninin yataylığına bağlı olarak 20-40 dilim içeren z serisi görüntüler üretilerek mikroskopi seansı sırasında (tipik olarak 20-30 dk) görüntülenmiştir.
Spinal motor nöronlarda optogenetik TDP-43'ün sitoplazmik yer değiştirmesinin görselleştirilmesi
OpTDP-43h'nin tek spinal motor nöronlarda sitoplazmik olarak yer değiştirmesini görselleştirmek için, 48 ve 72 hpf'de elde edilen z serisi görüntüler (tipik olarak 20-40 dilim) Fiji ile açıldı ve her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h kanalına ayrıldı. EGFP-TDP-43z'nin maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri 48 ve 72 hpf'deki görüntüler için oluşturulmuş ve her iki görüntüde de 48 ve 72 hpf'de tanımlanabilen tek bir izole spinal nöron seçilmiştir (Şekil 2B, oklar). Motor kolonun dorsal tarafında bulunan hücre cisimli spinal motor nöronlar seyrek dağılım şekilleri nedeniyle hücre vücut şeklinin ölçüleri için uygun kabul edildi.
EGFP-TDP-43z görüntülerde EGFP sinyalinin yoğunluğu ayarlandıktan sonra, EGFP sinyalinin kenarı 48 ve 72 hpf olarak izlenerek motor nöronların somalarını kaplayan ROI'ler ayarlanmıştır (Şekil 2C). Somanın ana ekseni boyunca floresan yoğunluğu EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h sinyalleri için 48 ve 72 hpf olarak ölçüldü (Şekil 2C, sağ). 48 hpf'de opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyallerinin desenleri büyük ölçüde üst üste geldi.
Buna karşılık, 72 hpf'de, EGFP-TDP-43z sinyalinin düşük olduğu bölgede, yani sitoplazmada opTDP-43h'nin sitoplazmik yer değiştirmesini gösteren opTDP-43h sinyalinin zirvesi bulundu. Işığa bağımlı sitoplazmik opTDP-43h yer değiştirme, optogenetik olmayan TDP-4314'ten büyük ölçüde bağımsız olarak başlatılır. Bu testte, nicel ölçümler pahasına çekirdek/sitoplazm sınırının konumunu tahmin etmek için maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri kullanılmıştır.
Spinal motor nöronlarda optogenetik ve optogenetik olmayan TDP-43'ün floresan yoğunluğunun oranmetrik karşılaştırması
Mavi ışık stimülasyonunun dalgalanan opTDP-43h protein düzeyleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için EGFP-TDP-43z sinyaline istinaden ışık stimülasyonundan önce ve sonra hücre gövdesindeki opTDP-43h sinyalleri ölçüldü. Omurga hemisegmenti de dahil olmak üzere z serisi görüntüler Fiji ile açıldı. Tek spinal motor nöronları kapsayan ROI'leri ayarlamak için EGFP-TDP-43z sinyalinin maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri 48 ve 72 hpf için oluşturulmuş ve hem 48 hem de 72 hpf görüntüde tanımlanabilen tek izole spinal nöronlar seçilmiştir (Şekil 3A). Serbest seçimler kullanılarak, 48 ve 72 hpf görüntülerinin her biri için ROI'ler çizildi ve bir yatırım getirisi yöneticisine kaydedildi (Şekil 3A). EGFP-TDP-43z sinyalinin maksimum yoğunluk projeksiyonu, yüksek kontrastı nedeniyle ROI'leri ayarlamak için uygun görüldü.
OpTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyallerini ölçmek için, sum dilimleri projeksiyon görüntüleri aynı z serisi görüntülerin her kanalı için 48 ve 72 hpf için üretilmiştir (Şekil 3A). Kayıtlı yatırım getirisi setleri kullanılarak, her zaman noktası için opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z floresan yoğunlukları ölçüldü. Her hücre ve zaman noktası için OPTDP-43h ile EGFP-TDP-43z (RFP/GFP değerleri) arasındaki göreli tutarlar RFP değerinin GFP değerine bölünmesiyle hesaplanmıştır (Şekil 3B). Araştırılan dört mnr2b pozitif hücreden 1 numaralı hücrede özellikle doymuş bir EGFP-TDP-43z sinyali gösterildi (Şekil 3A). Doymuş floresan sinyallere sahip hücreler nicel analizler yaparken veri kümelerinden dışlanmalıdır. #2-#4 hücreleri, daha büyük ölçekli olmasına rağmen, mavi ışık aydınlatmasından sonra EGFP-TDP-43z'ye göreli opTDP-43h seviyelerinin azalan eğilimlerini görüntüledi (Şekil 3B) analiz daha önce EGFP-TDP-43z'ye göre opTDP-43h düzeylerindeki azalmanın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını göstermiştir (üç bağımsız hayvandan 65 hücre)14.
Şekil 1: mnr2b lokus kullanılarak BAC DNA'sının yapımı. (A) opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z için ifade kasetlerinin yapıları. (B) CH211-172N16 BAC DNA'sı tarafından taşınan zebra balığı genomik bölgesi. opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z için PCR-amplified ifade kasetleri, mnr2b'nin (kırmızı ok) 5′-çevrilmemiş bölgesinin (UTR) homolog rekombinasyon ile mnr2b'nin ilk eksonunda aşağı doğru yerleştirilir. Çubuklar 500 (A) ve 10k (B) bp'yi gösterir.
Şekil 2: OpTDP-43h'nin ışık stimülasyonundan önce ve sonra canlı görüntülenmesi. (A) Sınırsız Tg spinal motor nöronlarında ifade edilen opTDP-43h ışık stimülasyon şeması[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balık 48 ila 72 hpf mavi LED ışık alan aydınlatması yoluyla. (B) Işık stimülasyonundan önce (48 hpf) ve sonra (72 hpf) ventral omuriliğin z serisi konfokal görüntülerinin maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri. Kesik çizgiler omuriliğin ventral sınırını çizer. Şekiller, 24 saat mavi ışık aydınlatmasından sonra opTDP-43'ün Asakawa ve ark.14 (C) Sitoplazmik yanlış sapkalizasyonundan uyarlanmıştır. 48 ve 72 bgf'de gözlenen mnr2b pozitif hücrenin (B'de kırmızı oklar) somasının konturları macenta olarak gösterilmiştir. Somaların ana eksenleri açık mavi ile gösterildi. Ana eksenler boyunca normalleştirilmiş floresan yoğunluğu çizildi. Yıldız işareti, sitoplazmik opTDP-43h yanlış hesaplamasını gösteren güçlü bir EGFP-TDP-43z çakışan sinyal göstermeyen güçlü opTDP-43 sinyal kümesini gösterir. Çubuklar 1 mm (A), 20 μm (B) ve 4 μm (C) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OpTDP-43h ve EGFP-TDP-43z'nin ışık stimülasyonu öncesi ve sonrası oranmetrik karşılaştırmaları. (A) 48 ve 72 hpf'deki dört tek mnr2b pozitif hücrenin somalarını kapsayan ROI'ler EGFP-TDP-43z sinyaline göre çizilmiş ve macenta olarak gösterilmiştir. Dikdörtgen ROI'ler (bg) arka plan sinyalini (arka plan yatırım getirisi) çıkarmak için kullanıldı. Şekiller Asakawa ve ark.14 'ten uyarlanmıştır (B) OpTDP-43h'nin EGFP-TDP-43z'ye göreli yoğunlukları her zaman noktasında RFP/GFP oranı olarak çizilmiştir. Yıldız işaretiyle gösterilen #1 hücresi, EGFP-TDP-43z sinyali doygun olduğu ve RFP/GFP değeri fazla tahmin edildiği için orantometrik karşılaştırma için uygun değildi. Çubuk 10 μm'yi gösterir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balıklarında opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z'nin mnr2b-BAC aracılı ifadesi, spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişinin canlı görüntülenmesi için eşsiz bir fırsat sağlar. Zebra balığı larvalarının vücut dokularının optik şeffaflığı, opTDP-43h'nin basit ve noninvaziv optogenetik stimülasyonuna izin verir. Zaman içinde tek spinal motor nöronlar arasındaki karşılaştırmalar, opTDP-43h'nin ışığa bağımlı oligomerizasyonunun ALS patolojisini andıran sitoplazmik kümelenmesine neden olduğunu göstermiştir.
Özünde düzensiz bir proteinin faz davranışını tanımlayan kritik parametrelerden biri hücre içi konsantrasyondur. Yüksek düzeyde opTDP-43h ifadesi, ışıktan bağımsız opTDP-43h oligomerizasyonuna, faz geçişine ve toplamasına yol açabilir. Bu nedenle, spinal motor nöronlarda stabil, toksik olmayan opTDP-43h ekspresyon seviyesinin indüksiyonu, opTDP-43 faz geçişinin spinal motor nöronlar üzerindeki fizyolojik ve patolojik sonuçlarının başarılı bir şekilde değerlendirilmesinde anahtardır. opTDP-43 h'nin mnr2b-BAC aracılı ifadesi bu amaç için uygun görünmektedir, çünkü Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] balık ağırlıklı olarak nükleer opTDP-43 gösterir, şişirilmiş bir yüzme mesanesi ile serbest yüzme yeteneğine sahiptirler ve 1-5 dpf'den sürekli karanlık koşullar altında yükseltildikten sonra bile tam canlılıklarını korurlar. Zebra balıklarında, ilgi çekici bir geni eksojen olarak ifade etmek için kullanılan geleneksel bir yaklaşım, tek hücreli aşamada mRNA enjeksiyonudur. Bununla birlikte, enjekte edilen mRNA'dan aynı anda çevrilen yüksek dozda TDP-43 proteini, daha sonra farklılaşan spinal motor nöronların analizlerini önleyen erken gelişimsel kusurlara neden olur14. Bununla birlikte, enjekte edilen mRNA miktarını tolere edilebilir bir seviyeye düşürmek, farklılaşma sırasında spinal motor nöronlarında optogenetik modülasyon için yeterli opTDP-43h sağlayamaz, bu da mRNA enjeksiyonunun zebra balıklarının spinal motor nöronlarına opTDP-43h teslim etmek için uygun bir yöntem olmadığını gösterir. Spinal motor nöronlarda opTDP-43h'yi ifade etmek için kullanılan bir başka olası yaklaşım, tek hücreli aşamada, omurilik motoru nöronunda aktif olan bir promotörün kontrolü altında opTDP-43h yapısını barındıran bir plazmid veya BAC DNA enjekte etmektir. Mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA'sının enjeksiyonu spinal motor nöronlarda opTDP-43h ekspresyonunu yönlendirebilse de, opTDP-43h-pozitif motor nöronların sayısı düşüktür ve bu tür sayısal olarak kısıtlanmış opTDP-43h-pozitif hücrelerde, ifade seviyesi genellikle yüksektir, genellikle ışıktan bağımsız opTDP-43h toplama ile ilişkilidir. Bu gözlemler toplu olarak transgenik ifadenin, spinal motor nöronlarda opTDP-43h'yi toksik olmayan bir seviyede saptayarak ifade etmek için yeri doldurulamaz bir strateji olduğunu göstermektedir. Özellikle, mnr2b-BAC zebra balığındaki hemen hemen tüm spinal motor nöronları etiketlese de20,23, opTDP-43h'nin ekspresyon seviyeleri bireysel mnr2b pozitif hücreler arasında değişebilir. Bu varyasyon kısmen motor nöron farklılaşmasındaki düzenleyici rolü ile ilişkili mnr2b'nin içsel ekspresyon patinasyonundan kaynaklanabilir. Alacalı ifadenin başka bir olası nedeni, mnr2b-BAC kesici uçları üzerinde kromozomal konum etkisinden neden olabilir. Nedeni ne olursa olsun, mnr2b pozitif hücreler arasındaki çeşitli opTDP-43 ekspresyon düzeyleri ışığa bağımlı opTDP-43h faz geçişi ile ilişkili sitotoksiklikte değişime neden olabilir.
Zebra balığı larvalarında, spinal motor nöronların somaları ventral omurilikte yoğun bir şekilde hizalanır ve somal sitoplazm aksonal sitoplazmdan çok daha düşük bir hacme sahiptir. Bu anatomik özellik, spinal motor nöronlarda sitoplazmik opTDP-43h'nin nicel analizlerini sınırlar: opTDP-43h sadece çekirdek ve somal sitoplazmada nicel olarak ölçülebilir, ancak motor nöronların tüm hücresinde ölçülmez. Soma ve periferik sinir terminali de dahil olmak üzere spinal motor nöronların tüm hücresinde bir proteinin nicel görüntülenmesi zor bir iş olmaya devam etmektedir. Nicel tahlillerdeki kısıtlamalara rağmen, somadaki opTDP-43h/EGFP-TDP-43z oranının IDR (A315T)14'teki ALS'ye neden olan mutasyonla yükseldiği gösterilmiştir. Bu nedenle, mevcut yöntem, TDP-43 mutasyonunun spinal motor nöronların somasında faz geçişi ile ilişkili protein stabilitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için geçerlidir.
Prensip olarak, mnr2b-BAC yaklaşımı LLPS'yi modüle etmek ve TDP-43'ün ötesinde IDR'lere sahip diğer ALS ile ilgili RNP proteinlerinin sitotoksikliğini değerlendirmek için genişletilebilir. Spinal motor nöronlarda bu tür optogenetik probların optimal bir ifade seviyesini elde etmek için çeşitli protokol adımlarının ayarlanması gerekebilir. İlk olarak, Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] transgenik yapısında, hsp70l promotör mnr2b arttırıcılar tarafından yönlendirilen opTDP-43h ekspresyonını artırmak için bazal promotör olarak kullanıldı. Hsp70l promotörü, ilgi çekici bir proteinin ifade seviyesi ışıktan bağımsız ektopik faz geçişine neden olacak kadar yüksekse BAC yapısından çıkarılabilir. İkinci olarak, opTDP-43h, mavi ışık aydınlatması22'deki kümeleme kapasitesini artıran bir nokta mutasyonu taşıyan bir fotoliaz homoloji (PHR) etki alanı olan CRY2olig etiketi ile donatılmıştır. Işığa bağımlı kümelenme aktivitesini hafifletmeye ihtiyaç varsa, vahşi tip protein CRY2PHR ışığa bağımlı oligomerizasyon etiketi olarak kullanılabilir. Son olarak, zebra balıklarında ALS patolojisini daha sadık bir şekilde yeniden özetlemek için, balık fizyolojisinin çocuk ve yetişkin aşamalarında mavi ışığın alan aydınlatması tarafından minimum düzeyde etkilendiği bir aydınlatma protokolü oluşturulması arzu edilir. Mevcut yöntem 48 ila 72 hpf (24 saat için) arasında sürekli mavi ışık aydınlatması kullanır ve aydınlatma süresi balık canlılığını kaybetmeden 120 hpf'ye (72 saat için) kadar uzatılabilir14, ancak görme gibi ışığa duyarlı fizyolojik işlevler etkilenebilir. Aralıklı ışık aydınlatması için bir protokol geliştirerek, çok daha uzun süreli ışık stimülasyonu mümkün olabilir, bu da opTDP-43h'nin daha olgun patolojik agregalara dönüşmesini kolaylaştırabilir. Bunu başarmak için, daha az fizyolojik olarak rahatsız edici24 olan farklı ışık dalga boylarını kullanarak protein-protein etkileşimlerini modüle etmek için diğer optogenetik problar da daha fazla araştırmaya değer olabilir. Bu tür geliştirilmiş optogenetik TDP-43 problarının kombinasyonları, hastalığa karşı savunmasız hücre tiplerini hedefleyen uygun promotörler ve fizyolojik işlevler üzerinde minimum etkiye sahip aydınlatma protokolleri, TDP-43 proteinopatilerinin patolojilerini sadece omurilikte değil, beyinde de sadık bir şekilde modellemek için yollar açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
KA ve KK, bu yazıda açıklanan fikri mülkiyetin mucitleridir ve Geçici patentler Ulusal Genetik Enstitüsü tarafından sunulmuştur.
Acknowledgments
Bu çalışma SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numaraları JP19K06933 (KA) ve JP20H05345 (KA) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F.
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K.
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al.
