מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון מחייב DNA TAR 43 (TDP-43) על ידי אור בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה באמצעות דגי זברה כמודל.
Abstract
צבירת חלבונים חריגה ופגיעות עצבית סלקטיבית הם שני סימני היכר עיקריים של מחלות ניווניות. קשרים סיבתיים בין תכונות אלה עשויים להיחקר על ידי שליטה במעבר הפאזה של חלבון הקשור למחלה בסוג תא פגיע, אם כי גישה ניסיונית זו הוגבלה עד כה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון RNA / DNA מחייב TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה למידול צבירה ציטופלסמית של TDP-43 המתרחשת בנוירונים מוטוריים מנוונים בטרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS). אנו מתארים שיטה גנטית מבוססת כרומוזום מלאכותי חיידקי (BAC) כדי לספק גרסה אופטוגנטית TDP-43 באופן סלקטיבי לנוירונים המוטוריים בעמוד השדרה של דגי זברה. השקיפות הגבוהה של זחלי דגי זברה מאפשרת מעבר פאזה של TDP-43 האופטוגנטי בתאי העצב של מנוע עמוד השדרה על ידי תאורה חיצונית פשוטה באמצעות דיודה פולטת אור (LED) נגד דגים בלתי מרוסנים. אנו מציגים גם זרימת עבודה בסיסית של הדמיה חיה של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של דגי הזברה וניתוח תמונה עם תוכנת פיג’י / ImageJ זמינה באופן חופשי כדי לאפיין את התגובות של TDP-43 האופטוגנטי לתאורת האור. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של מעבר שלב TDP-43 ויצירת צבירה בסביבה תאית פגיעה ALS, אשר אמור להקל על חקירה של ההשלכות התאיות וההתנהגותיות שלה.
Introduction
גרגרי ריבונוקלאופרוטאין (RNP) שולטים בשלל פעילויות תאיות בגרעין ובציטופלסמה על ידי הרכבת מחיצות ללא ממברנה באמצעות הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS), תופעה שבה נוזל הומוגני מתפוגג לשני שלבים נוזליים נפרדים1,2. ה- LLPS המופסק של חלבונים מחייבי RNA המתפקדים בדרך כלל כרכיבי גרגירי RNP מקדמים מעבר פאזה חריג, מה שמוביל לצבירה של חלבונים. תהליך זה היה מעורב במחלות נוירו-מפותחות ונוירודגנרטיביות3,4,5. ההערכה המדויקת של קשר סיבתי בין LLPS חריג של חלבונים מחייבי RNA ופתוגנזה של מחלות חיונית לקביעת האם וכיצד ניתן לנצל LLPS כיעד טיפולי יעיל. LLPS של חלבונים מחייבי RNA קל יחסית ללמוד במבחנה ובמודלים חד-תאיים אך קשה באורגניזמים רב-תאיים, במיוחד בחולייתנים. דרישה קריטית לניתוח LLPS כזה בתאים בודדים בתוך סביבת רקמות היא לבטא ביציב בדיקה עבור הדמיה ומניפולציה של LLPS בסוג של עניין תאים פגיעים למחלה.
טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא הפרעה נוירולוגית קטלנית בסופו של דבר שבה נוירונים מוטוריים של המוח וחוט השדרה הולכים לאיבוד באופן סלקטיבי ומתקדם עקב ניוון. עד כה, מוטציות ביותר מ-25 גנים קושרו לצורה תורשתית (או משפחתית) של ALS, המהווה 5%-10% מכלל מקרי ה-ALS, וחלק מהגנים הגורמים ל-ALS מקודדים חלבונים מחייבי RNA המורכבים מ-RNPs, כגון hnRNPA1, TDP-43 ו-FUS6,7. יתר על כן, הצורה ספורדית של ALS, המהווה 90%-95% מכלל מקרי ALS, מאופיינת בצבירה ציטופלסמית של TDP-43 המופקדת בנוירונים מוטוריים מתנוונים. מאפיין מרכזי של חלבונים אלה הקשורים ALS RNA מחייב הוא האזורים שלהם הפרעה מהותית (IDRs) או תחומים בעלי מורכבות נמוכה, כי חסרים מבנים תלת ממדיים מסודרים ולתווך אינטראקציות חלבון חלבון חלש עם חלבונים רבים ושונים המניעים LLPS7,8. העובדה כי מוטציות הגורמות ALS מתרחשות לעתים קרובות IDRs הוביל את הרעיון כי LLPS חריג ומעבר פאזה של חלבונים אלה הקשורים ALS עשויים לעמוד בבסיס ALS פתוגנזה9,10.
לאחרונה, פותחה שיטת optoDroplet, טכניקה אופטוגנטית מבוססת Cryptochrome 2 המאפשרת אפנון של אינטראקציות חלבון-חלבון על ידי אור, פותחה כדי לגרום למעבר פאזה של חלבונים עם IDRs11. כמו טכניקה זו הורחבה בהצלחה TDP-43, זה החל לחשוף את המנגנונים הבסיסיים מעבר פאזה פתולוגית של TDP-43 ואת הציטוטוקסיות הקשורים שלה12,13,14,15. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה גנטית כדי לספק TDP-43 אופטוגנטי לסוגי תאים פגיעים ALS, כלומר, נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה בדגי זברה באמצעות BAC עבור הגן mnr2b / mnx2b קידוד חלבון homeodomain עבור מפרט נוירון מוטורי16,17. השקיפות הגבוהה של זחלי דגי הזברה מאפשרת גירוי אור פשוט ולא פולשני של TDP-43 האופטוגנטי שמפעיל את מעבר הפאזה שלו בתאי העצב של מנוע עמוד השדרה. אנו מציגים גם זרימת עבודה בסיסית להדמיה חיה של נוירונים מוטוריים של דגי זברה וניתוח תמונה באמצעות תוכנת פיג’י / ImageJ הזמינה באופן חופשי כדי לאפיין את התגובות של TDP-43 האופטוגנטי לגירוי האור. שיטות אלה מאפשרות חקירה של מעבר שלב TDP-43 בסביבה תאית פגיעה ALS וצריכים לסייע בחקר ההשלכות הפתולוגיות שלה ברמות התאיות וההתנהגותיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הביטוי בתיווך mnr2b-BAC של opTDP-43h ו- EGFP-TDP-43z בדגי זברה מספק הזדמנות ייחודית להדמיה חיה של מעבר שלב TDP-43 בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה. השקיפות האופטית של רקמות הגוף של זחלי דגי זברה מאפשרת גירוי אופטוגנטי פשוט ולא פולשני של opTDP-43h. השוואות בין נוירונים מוטוריים יחידים בעמוד השדרה לאורך זמן ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן SERIKA (KA), מספרי מענק KAKENHI JP19K06933 (KA) ו JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).
