Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish
Summary
Descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de DNA TAR 43 (TDP-43) por luz nos neurônios motores espinhais usando zebrafish como modelo.
Abstract
A agregação anormal de proteínas e a vulnerabilidade neuronal seletiva são duas marcas principais de doenças neurodegenerativas. As relações causais entre essas características podem ser interrogadas controlando a transição de fase de uma proteína associada à doença em um tipo celular vulnerável, embora essa abordagem experimental tenha sido limitada até agora. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de RNA/DNA TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish para modelagem da agregação citoplasmática de TDP-43 ocorrendo em neurônios motores degenerados na esclerose lateral amiotrófica (ELA). Descrevemos um método genético baseado em cromossomo artificial bacteriano (BAC) para fornecer uma variante optogenética TDP-43 seletivamente aos neurônios motores espinhais de zebrafish. A alta translucência das larvas de zebrafish permite a transição de fase do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais por uma simples iluminação externa usando um diodo emissor de luz (LED) contra peixes desenfreados. Também apresentamos um fluxo básico de imagens ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem com software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar respostas do TDP-43 optogenético à iluminação da luz. Este protocolo permite a caracterização da transição de fase TDP-43 e formação agregada em um ambiente celular vulnerável à ALS, o que deve facilitar a investigação de suas consequências celulares e comportamentais.
Introduction
Os grânulos de ribonucleoproteína (RNP) controlam uma miríade de atividades celulares no núcleo e citoplasma, montando partições sem membrana através da separação de fase líquido-líquido (LLPS), fenômeno no qual um fluido homogêneo se mistura em duas fases líquidas distintas1,2. Os LLPS desregulados de proteínas de ligação de RNA que normalmente funcionam como componentes de grânulo RNP promovem a transição de fase anormal, levando à agregação de proteínas. Esse processo foi implicado em doenças neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativas3,4,5. A avaliação precisa de uma relação causal entre LLPS aberrantes de proteínas ligantes de RNA e patogênese de doenças é crucial para determinar se e como o LLPS pode ser explorado como um alvo terapêutico eficaz. LLPS de proteínas de ligação de RNA é relativamente fácil de estudar in vitro e em modelos unicelulares, mas é difícil em organismos multicelulares, especialmente em vertebrados. Um requisito crítico para analisar tais LLPS em células individuais dentro de um ambiente tecidual é expressar uma sonda para a imagem e manipulação de LLPS em um tipo de interesse celular vulnerável à doença.
A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurológica fatal na qual os neurônios motores do cérebro e da medula espinhal são perdidos seletivamente e progressivamente devido à degeneração. Até o momento, mutações em mais de 25 genes foram associadas à forma herediável (ou familiar) da ELA, que representa 5%-10% do total de casos de ELA, e alguns desses genes causadores de ELA codificam proteínas de ligação de RNA constituídas por RNPs, como hnRNPA1, TDP-43 e FUS6,7. Além disso, a forma esporádica da ELA, que responde por 90%-95% do total de casos de ELA, é caracterizada pela agregação citoplasmática do TDP-43 depositado em neurônios motores degenerados. Uma das principais características dessas proteínas ligadas à RNA associadas à ALS são suas regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) ou domínios de baixa complexidade que carecem de estruturas tridimensionais ordenadas e mediam interações proteína-proteína fracas com muitas proteínas diferentes que impulsionam LLPS7,8. O fato de que mutações causadoras de ELA ocorrem frequentemente nos IDRs levou à ideia de que LLPS aberrantes e transição de fase dessas proteínas relacionadas à ELA podem estar por trás da patogênese da ALS9,10.
Recentemente, o método optoDroplet, uma técnica optogenética baseada em Cryptochrome 2 que permite a modulação de interações proteína-proteína por luz, foi desenvolvido para induzir a transição de fase de proteínas com IDRs11. Como esta técnica foi estendida com sucesso ao TDP-43, começou a descobrir os mecanismos subjacentes à transição de fase patológica do TDP-43 e sua citotoxicidade associada12,13,14,15. Neste protocolo, descrevemos um método genético para fornecer um TDP-43 optogenético para tipos de células vulneráveis à ALS, ou seja, neurônios motores espinhais em zebrafish usando o BAC para o gene mnr2b/mnx2b codificando uma proteína homeodomina para especificação de neurônio motor16,17. A alta translucência das larvas de zebrafish permite uma estimulação leve simples e não invasiva do TDP-43 optogenético que desencadeia sua transição de fase nos neurônios motores espinhais. Também apresentamos um fluxo de trabalho básico para a imagem ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem usando o software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar as respostas do TDP-43 optogenético à estimulação da luz. Esses métodos permitem uma investigação da transição de fase do TDP-43 em um ambiente celular vulnerável à ALS e devem ajudar a explorar suas consequências patológicas em níveis celulares e comportamentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A expressão mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43h e EGFP-TDP-43z em zebrafish fornece uma oportunidade única para imagens ao vivo da transição de fase TDP-43 nos neurônios motores espinhais. A transparência óptica dos tecidos corporais das larvas de zebrafish permite a simples e não invasiva estimulação optogenética de opTDP-43h. Comparações entre neurônios motores espinhais únicos ao longo do tempo demonstraram que a oligomerização dependente da luz do opTDP-43h causa seu agrupamento citoplasmical…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant números JP19K06933 (KA) e JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
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