Optogenetisk faseovergang av TDP-43 i spinalmotor neuroner av sebrafisk larver
Summary
Vi beskriver en protokoll for å indusere faseovergang av TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) ved lys i ryggmotornevronene ved hjelp av sebrafisk som modell.
Abstract
Unormal proteinaggregering og selektiv nevronsårbarhet er to store kjennetegn på nevrodegenerative sykdommer. Årsakssammenhenger mellom disse funksjonene kan bli forhørt ved å kontrollere faseovergangen av et sykdomsrelatert protein i en sårbar celletype, selv om denne eksperimentelle tilnærmingen har vært begrenset så langt. Her beskriver vi en protokoll for å indusere faseovergang av RNA/DNA-bindende protein TDP-43 i spinalmotoriske nevroner av sebrafisklarver for modellering av cytoplasmisk aggregering av TDP-43 som forekommer ved degenerering av motoriske nevroner i amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Vi beskriver en bakteriell kunstig kromosom (BAC)-basert genetisk metode for å levere en optogenetisk TDP-43-variant selektivt til spinalmotoriske nevroner av sebrafisk. Den høye gjennomskinneligheten til sebrafisk larver tillater faseovergangen av den optogenetiske TDP-43 i spinalmotornevronene ved en enkel ekstern belysning ved hjelp av en lysdiode (LED) mot uhemmet fisk. Vi presenterer også en grunnleggende arbeidsflyt for levende avbildning av sebrafisk spinalmotor nevroner og bildeanalyse med fritt tilgjengelig Fiji / ImageJ-programvare for å karakterisere responsen til den optogenetiske TDP-43 til lysbelysningen. Denne protokollen muliggjør karakterisering av TDP-43 faseovergang og aggregert dannelse i et ALS-sårbart cellemiljø, noe som bør lette en undersøkelse av cellulære og atferdsmessige konsekvenser.
Introduction
Ribonucleoprotein (RNP) granulater kontrollerer et utall cellulære aktiviteter i kjernen og cytoplasma ved å montere membranløse partisjoner via væske-væskefase separasjon (LLPS), et fenomen der en homogen væske demixes i to distinkte væskefaser1,2. Den dysregulerte LLPS av RNA-bindende proteiner som normalt fungerer som RNP-granulatkomponenter, fremmer unormal faseovergang, noe som fører til proteinaggregering. Denne prosessen har vært involvert i nevrodevelopmentale og nevrodegenerative sykdommer3,4,5. Den nøyaktige evalueringen av en årsakssammenheng mellom avvikende LLPS av RNA-bindende proteiner og sykdomspatogenese er avgjørende for å avgjøre om og hvordan LLPS kan utnyttes som et effektivt terapeutisk mål. LLPS av RNA-bindende proteiner er relativt lett å studere in vitro og i encellede modeller, men er vanskelig i multicellulære organismer, spesielt i vertebrater. Et kritisk krav for å analysere slike LLPS i enkeltceller i et vevsmiljø er å stabilt uttrykke en sonde for avbildning og manipulering av LLPS i en sykdomsseipømt celletype.
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en til slutt dødelig nevrologisk lidelse der motoriske nevroner i hjernen og ryggmargen er selektivt og gradvis tapt på grunn av degenerasjon. Til dags dato har mutasjoner i mer enn 25 gener vært assosiert med den arvelige (eller familiære) formen av ALS, som står for 5% -10% av totale ALS-tilfeller, og noen av disse ALS-forårsakende genene koder RNA-bindende proteiner som består av RNPer, for eksempel hnRNPA1, TDP-43 og FUS6,7. Videre er den sporadiske formen for ALS, som står for 90% -95% av totale ALS-tilfeller, preget av cytoplasmisk aggregering av TDP-43 deponert i degenererende motoriske nevroner. En viktig egenskap ved disse ALS-assosierte RNA-bindende proteinene er deres iboende uordnede regioner (IDRs) eller lavkompleksitetsdomener som mangler bestilte tredimensjonale strukturer og formidler svake proteinproteininteraksjoner med mange forskjellige proteiner som driver LLPS7,8. Det faktum at ALS-forårsakende mutasjoner ofte forekommer i IDR-ene, har ført til ideen om at avvikende LLPS og faseovergang av disse ALS-relaterte proteinene kan underbemanne ALS-patogenese9,10.
Nylig ble optoDroplet-metoden, en Cryptochrome 2-basert optogenetisk teknikk som tillater modulering av proteinproteininteraksjoner med lys, utviklet for å indusere faseovergang av proteiner med IDRs11. Siden denne teknikken har blitt utvidet til TDP-43, har den begynt å avdekke mekanismene som ligger til grunn for den patologiske faseovergangen til TDP-43 og den tilhørende cytotoksisiteten12,13,14,15. I denne protokollen skisserer vi en genetisk metode for å levere en optogenetisk TDP-43 til ALS-sårbare celletyper, nemlig spinalmotoriske nevroner i sebrafisk ved hjelp av BAC for mnr2b/mnx2b-genet som koder et homeodomainprotein for motorisk nevronspesifikasjon16,17. Den høye gjennomskinneligheten til sebrafisk larver gir enkel, ikke-invasiv lysstimulering av optogenetisk TDP-43 som utløser sin faseovergang i ryggmotornevronene. Vi presenterer også en grunnleggende arbeidsflyt for levende bildebehandling av sebrafisk spinalmotor nevroner og bildeanalyse ved hjelp av den fritt tilgjengelige Fiji / ImageJ-programvaren for å karakterisere responsen til den optogenetiske TDP-43 til lysstimuleringen. Disse metodene muliggjør en undersøkelse av TDP-43 faseovergang i et ALS-sårbart cellulært miljø og bør bidra til å utforske sine patologiske konsekvenser på cellulære og atferdsmessige nivåer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mnr2b-BAC-medierte uttrykket for opTDP-43h og EGFP-TDP-43z i sebrafisk gir en unik mulighet for levende bildebehandling av TDP-43 faseovergang i ryggmotornevronene. Den optiske gjennomsiktigheten av kroppsvev av sebrafisk larver gir mulighet for enkel og ikke-invasiv optogenetisk stimulering av opTDP-43h. Sammenligninger mellom enkle spinalmotoriske nevroner over tid viste at den lysavhengige oligomeriseringen av opTDP-43h forårsaker sin cytoplasmatiske klynger, som minner om ALS-patologi.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant-nummer JP19K06933 (KA) og JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).
