Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Summary

Crosstalk zwischen Brustepithelzellen und Endothelzellen trägt wesentlich zum Fortschreiten von Brustkrebs, Tumorwachstum und Metastasierung bei. In dieser Studie wurden Sphäroide aus Brustkrebszellen zusammen mit vaskulären und/oder lymphatischen Endothelzellen hergestellt und demonstrieren ihre Anwendbarkeit als In-vitro-System für die Brustkrebsforschung.

Abstract

Brustkrebs ist die häufigste Todesursache bei Frauen. Das Wachstum von Brustkrebszellen und deren anschließende Metastasierung ist ein Schlüsselfaktor für ihr Fortschreiten. Obwohl die Mechanismen, die an der Förderung des Brustkrebswachstums beteiligt sind, intensiv mit Monokulturen von Brustkrebszellen wie MCF-7-Zellen untersucht wurden, wurde der Beitrag anderer Zelltypen, wie vaskulärer und lymphatischer Endothelzellen, die eng am Tumorwachstum beteiligt sind, nicht eingehend untersucht. Die Zell-Zell-Interaktion spielt eine Schlüsselrolle für das Wachstum und die Progression von Tumoren. Die Neoangiogenese oder die Entwicklung von Gefäßen ist für das Tumorwachstum unerlässlich, während das Lymphsystem als Portal für die Migration von Krebszellen und die anschließende Metastasierung dient. Neuere Studien belegen, dass vaskuläre und lymphatische Endothelzellen das Wachstum von Krebszellen signifikant beeinflussen können. Diese Beobachtungen implizieren die Notwendigkeit, In-vitro-Modelle zu entwickeln, die Brustkrebswachstumsprozesse in vivorealistischer widerspiegeln würden. Darüber hinaus erfordern Einschränkungen in der Tierforschung die Entwicklung von Ex-vivo-Modellen, um die beteiligten Mechanismen besser aufzuklären.

Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Brustkrebs-Sphäroiden, die sowohl aus Brustkrebszellen (Östrogenrezeptor-positive MCF-7-Zellen) als auch aus vaskulären und/oder lymphatischen Endothelzellen bestehen. Das Protokoll beschreibt einen detaillierten Schritt-für-Schritt-Ansatz bei der Herstellung von Dual-Cell-Sphäroiden mit zwei verschiedenen Ansätzen, hängendem Drop (Goldstandard und billig) und 96-Well-U-Bodenplatten (teuer). Es werden detaillierte Anweisungen bereitgestellt, wie die gebildeten Sphäroide vorsichtig aufgenommen werden können, um das Wachstum durch mikroskopische Größenbestimmung zu überwachen und die Lebensfähigkeit durch Färbung toter und lebender Zellen zu beurteilen. Darüber hinaus werden Verfahren zur Fixierung der Sphäroide zum Schneiden und Färben mit wachstumsspezifischen Antikörpern zur Differenzierung von Wachstumsmustern in Sphäroiden beschrieben. Zusätzlich werden Details zur Herstellung von Sphäroiden mit transfizierten Zellen und Methoden zur Extraktion von RNA für die molekulare Analyse bereitgestellt. Zusammenfassend enthält dieser Artikel detaillierte Anweisungen zur Vorbereitung von mehrzelligen Sphäroiden für die Brustkrebsforschung.

Introduction

Die Verwendung von Tieren für Experimente hat Grenzen. Tierstudien können das Fortschreiten der Krankheit beim Menschen nicht genau nachahmen, und Tiere und Menschen haben keine identischen Reaktionen auf Krankheitserreger. Darüber hinaus Einschränkungen bei Tierversuchen aufgrund von Bedenken hinsichtlich Tierleid und ethischer Probleme^1,2 forschungsprogramme zunehmend einschränken. In vitro Systeme zur Umgehung der Verwendung von Tieren wurden in großem Umfang entwickelt; Darüber hinaus hat die Verwendung menschlicher Zellen dazu geführt, dass in vitro Modelle, die für die pathophysiologische und therapeutische Untersuchung relevanter sind. Herkömmliche Monolayer (2D) Zellkulturen sind weit verbreitet, weil sie menschliches Gewebe bis zu einem gewissen Grad nachahmen. 2D-Monokulturen können jedoch keine menschlichen Organe nachahmen, und 2D-Monokulturen sind nicht in der Lage, die komplexe Mikroumgebung der ursprünglichen Organe zu simulieren und die in vivo Situation^3,4,5,6. Darüber hinaus könnten in monoschichtigen Zellkulturen medikamentöse Behandlungen leicht alle Zellen zerstören / schädigen. Wichtig ist, dass einige dieser Einschränkungen durch die Umstellung auf mehrschichtige dreidimensionale (3D) Zellkulturen überwunden werden können.^7,8. Tatsächlich wurde gezeigt, dass 3D-Kulturmodelle die zelluläre Struktur, das Layout und die Funktion von Zellen in Primärgeweben besser widerspiegeln. Diese 3D-Kulturen können aus einer Vielzahl von Zelllinien gebildet werden, ähnlich einem funktionellen Organ. Tatsächlich gibt es zwei Modelle von 3D-Kulturen. Ein Modell erzeugt Sphäroide von aggregierten Zellen, die Cluster bilden und sie in Kugeln (gerüstfreie Modelle) umorganisieren. Die zweite ergibt Organoide, die eine komplexere Struktur haben und aus Kombinationen mehrerer organspezifischer Zellen bestehen, die als Miniaturversion von Organen betrachtet werden.^9,10. Aus diesem Grund stellen 3D-Kultursysteme eine innovative Technologie mit vielen biologischen und klinischen Anwendungen dar. So haben Sphäroide und Organoide zahlreiche Anwendungen für die Krankheitsmodellierung und Studien im Zusammenhang mit regenerativer Medizin, Arzneimittelscreening und toxikologischen Studien.^{6,11,12,13,14,15}. Karzinogene Sphäroide, abgeleitet von der 3D-Technologie, bilden die Morphologie und den Phänotyp relevanter Zelltypen nach und ahmen die in vivo Tumormikroumgebung und Modellzellkommunikation und Signalwege, die während der Tumorentwicklung funktionsfähig sind^16,17,18. Um das Verständnis der Krebsbiologie zu verbessern, können Tumorsphäroide / Organoide auch verwendet werden, um eine potenzielle patientenspezifische Krebstherapie (personalisiert) zu identifizieren und ihre Wirksamkeit, Toxizität und Langzeitwirkungen zu bewerten.^19,20,21,22. Sphäroide haben prominente Möglichkeiten eröffnet, Pathophysiologie, Krankheitsmodellierung und Drogenscreening zu untersuchen, da sie in der Lage sind, die zelluläre und dreidimensionale Gewebearchitektur zu erhalten, die Fähigkeit, die in vivo -Situation und die Zell-Zell-Interaktionen. Man muss sich jedoch auch der Einschränkungen dieses Systems bewusst sein, wie dem Fehlen einer vaskulären / systemischen Komponente, eines funktionellen Immun- oder Nervensystems, und das System stellt im Vergleich zu Tiermodellen einen reduktionistischen Ansatz dar. Tatsächlich bieten 3D-Strukturen im Gegensatz zu Tiermodellen nur eine Annäherung an die Biologie innerhalb eines menschlichen Körpers. Das Verständnis der Grenzen der 3D-Methode kann Forschern helfen, verfeinerte und validere Prozesse zur Herstellung von Sphäroiden zu entwickeln, die ein Organ in einem größeren Maßstab besser darstellen^23,24,25.

Krebs ist die häufigste Todesursache weltweit, und Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen^26,27,28. Um die komplexe Mikroumgebung von Brustkrebs nachzuahmen, sollten Brustkrebs-Sphäroide mit Zellen kultiviert werden, die eine herausragende Rolle bei Brusttumoren spielen, d. H. Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und / oder Immunzellen. Darüber hinaus sollten bei einem Sphäroid, das Brustkrebs darstellt, auch die Expression weiblicher Hormonrezeptoren (Östrogen-/Progesteronrezeptoren), die Fähigkeit, den histologischen Status des Patiententumors zu erhalten, und die Fähigkeit, das Ansprechen auf die Therapie nachzuahmen, in Betracht gezogen werden. Studien haben gezeigt, dass 3D-Kokultursysteme eine zelluläre Organisation ähnlich der des Primärgewebes in vivohaben, die Fähigkeit haben, in Echtzeit auf Reize zu reagieren, und funktionelle Androgenrezeptoren haben^29,30,31,32. Daher könnte ein ähnlicher Ansatz nützlich sein, um einen Brusttumor in vitro nachzuahmen. Der Zweck des aktuellen Protokolls ist es, eine neue Methode zur Erzeugung von Brustkrebs-Sphäroiden zu etablieren. Diese Methode verwendet Östrogenrezeptor-positive MCF-7-Zellen (eine immortalisierte menschliche Zelllinie von Epithelzellen) und vaskuläre Endothelzellen (HUVECs) oder lymphatische Endothelzellen (HMVEC-DNeo), um ein Modell zu erstellen, das die Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen innerhalb eines Tumors nachahmt oder genau widerspiegelt. Obwohl MCF-7 (Östrogen-responsive) und Endothelzellen verwendet wurden, um Sphäroide in der vorliegenden Studie zu entwickeln, könnten andere Zellen wie Fibroblasten, die ~ 80% der Brusttumormasse ausmachen, in Zukunft ebenfalls kombiniert werden, um den Brusttumor besser darzustellen und nachzuahmen.

Es gibt mehrere Methoden, um Sphäroide zu bilden, wie zum Beispiel: 1) die hängende Tröpfchenmethode, die die Schwerkraft^{verwendet 33,34}; 2) die Magnetschwebemethode, bei der magnetische Nanopartikel verwendet werden, die einem externen Magneten³⁵ausgesetzt sind, und 3) die sphäroide Mikrotiterplattenmethode, die durchgeführt wird, indem Zellen auf Platten mit geringer Befestigung^36,37gesetzt werden. Auf der Grundlage der bestehenden Methoden, die nur einen Zelltyp verwenden, wurde das vorliegende Protokoll unter Verwendung von Epithel- und Endothelzellen optimiert, um die Wachstumsbedingungen von Brustkrebstumoren in vivobesser nachzuahmen^38,39,40,41. Diese Methode kann leicht im Labor zu geringen Kosten und mit minimalem Gerätebedarf erreicht werden. Basierend auf dem Bedarf / den Zielen des Labors wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Sphäroide zu bilden und relevantes zelluläres Material aus diesen Sphäroiden zu gewinnen. In diesem Zusammenhang werden die 3D-Sphäroide für die DNA-, RNA- oder Proteinanalyse durch Co-Kultivierung von Endothel- und Epithelzellen mit der Hanging-Drop-Methode hergestellt. Für funktionelle Studien, zum Beispiel zur Überwachung des Zellwachstums nach kurzer interferierender (siRNA) Transfektion und/oder Hormonbehandlung, werden die Sphäroide jedoch über U-Bodenplatten erzeugt.

Der Zweck dieses technischen Protokolls besteht darin, eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung für 1) die Bildung von mehrzelligen Sphäroiden von Brustkrebs, 2) die Vorbereitung von Proben für die histologische Färbung und 3) die Sammlung von Zellen für die Extraktion von RNA, DNA und Proteinen bereitzustellen. Sowohl die kostengünstige Hängetropfenmethode als auch die teureren U-Bodenplatten werden zur Bildung von Sphäroiden verwendet. Hier wird ein Protokoll zur Vorbereitung (Fixierung) von Sphäroiden für die Schnittung und anschließende Immunfärbung mit Markern zur Beurteilung der Zellproliferation, Apoptose und Verteilung von Epithel- und Endothelzellen innerhalb eines Sphäroids bereitgestellt. Darüber hinaus zeigt dieses Protokoll eine vollständige Schritt-für-Schritt-Analyse histologischer Daten mit der ImageJ-Software. Die Interpretation biologischer Daten variiert je nach Art des Experiments und den verwendeten Antikörpern. Die Schnittung der fixierten Sphäroide und die anschließende Färbung der Schnitte wurde von einem routinemäßigen Pathologielabor durchgeführt (Sophistolab: info@sophistolab.ch).

Protocol

1. Zellkultur HINWEIS: Führen Sie die Zellhandhabung unter sterilen Bedingungen durch. Subkultur menschlicher Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs) 75 cm2 Kolben mit Kollagen (5 μg/cm2) (Rattenschwanz) über Nacht (ON) bei Raumtemperatur (RT) oder 2-3 h bei 37 °C beschichten, mit Wasser abspülen und den Kolben trocknen lassen. HUVECs in Wachstumsmedium (EBM-2, Endothelial Basal Medium-2) anbauen, ergänzt mit Glutamin (1x = 2 mM), antibiot…

Representative Results

Das Sphäroidmodell unter Verwendung von epithelialen und endothelialen Co-Kulturen ist erforderlich, um die In-vivo-Bedingungen von Brusttumoren für In-vitro-Experimente genau nachzuahmen. Das Schema in Abbildung 1 zeigt das Protokoll zur Bildung von Sphäroide mit Brustkrebsepithelzellen und vaskulären oder lymphatischen Endothelzellen (Abbildung 1). Jeder Zelltyp wird separat in einer 3,5 cm langen runden Schale ausgesät und mit Wachstums…

Discussion

Im Vergleich zu 2D-Zellkulturen ist die revolutionäre 3D-Sphäroidkulturtechnologie ein besseres und leistungsfähigeres Werkzeug, um die Mikroumgebung, Zell-Zell-Interaktionen und Arzneimittelreaktionen eines Organs in vitrozu rekonstruieren. Dies ist das erste Protokoll, das die Bildung von Sphäroiden aus mehrzelligen (epithelialen und endothelialen) Zelllinien für die Brustkrebsforschung beschreibt. Dieses Protokoll gewährleistet das sphäroide 3D-Wachstum von Sphäroiden für bis zu 5 Tage, und Sphäroid…

Materials

100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile	Falcon	357543
Adobe Photoshop			Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31 (cluster of differentiation 31)	Cell Marque	131M-95	monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	Invitrogen	C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)	DBS	Mob189-05	monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope	Olympus Life Science		Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3	Cell Signaling	9661L	polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter	Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar	BD Difco	BD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2	Lonza	190860
Ethidium homodimer	Sigma-Aldrich	46043
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA	Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
ImageJ	National Institute of Health, USA		Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)
Ki67	Cell Marque	275R-16	monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome		149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Gibco	S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line	Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich		Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate	Thermo Fisher Scientific	174925
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Protein Lysis Buffer	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055
RNA Lysis Buffer	Zymo Research	R1060-1-100	Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge	Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL	Falcon	352003
Sonicator	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader	Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75	TPP	90076
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924