乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド
Summary
乳腺上皮細胞と内皮細胞との間のクロストークは、乳癌の進行、腫瘍の増殖、転移に重要な貢献をする。本研究では、スフェロイドは、血管および/またはリンパ内皮細胞と共に乳癌細胞から作られ、乳癌研究のための インビトロ システムとしての適用性を実証した。
Abstract
乳癌は女性の死亡率の主な原因である。乳癌細胞の増殖とその後の転移は、その進行の重要な要因である。MCF-7細胞などの乳がん細胞の単培養を用いて乳癌の増殖促進に関与するメカニズムは鋭意的に研究されているが、腫瘍増殖に密接に関与している血管およびリンパ系内皮細胞などの他の細胞タイプの寄与は、深く調べられていない。細胞間相互作用は、腫瘍の成長と進行において重要な役割を果たす。腫瘍の成長にはネオアン血管新生(血管の発達)が不可欠であるのに対し、リンパ系は癌細胞の移動とその後の転移のポータルとして機能する。最近の研究は、血管およびリンパ系内皮細胞が癌細胞の増殖に大きな影響を与えることができるという証拠を提供する。これらの観察は、より現実的にin vivoで乳癌の成長過程を反映するインビトロモデルを開発する必要性を意味する。さらに、動物研究における制限は、関連するメカニズムをより良く解明するためにex vivoモデルの開発を必要とする。
本稿では、乳癌細胞(エストロゲン受容体陽性MCF-7細胞)と血管および/またはリンパ内皮細胞の両方で構成される乳癌スフェロイドの開発について説明する。このプロトコルは、吊り下げ(ゴールドスタンダードと安価)と96ウェルUボトムプレート(高価)の2つの異なるアプローチを使用してデュアルセルスフェロイドを作成する詳細なステップバイステップアプローチを記述しています。形成されたスフェロイドを繊細に拾い上げ、微視的なサイジングによって成長を監視し、死んだ細胞染色と生きた細胞染色を使用して生存率を評価する方法について詳しく説明します。さらに、スフェロイドの成長パターンを区別するために増殖特異的抗体で切り離し染色するためのスフェロイドを固定する手順が線引く。さらに、トランスフェクションされた細胞を用いてスフェロイドを調製するための詳細と、分子解析のためにRNAを抽出する方法が提供される。結論として、この記事では、乳がん研究のための多細胞スフェロイドを準備するための詳細な手順を提供します。
Introduction
実験のための動物の使用には限界があります。動物実験はヒトの疾患進行を正確に模倣することはできず、動物とヒトは病原体に対して同一の反応を示さない。さらに、動物の苦しみや倫理的問題に対する懸念による動物実験の制限1,2 研究プログラムをますます制約する。 In vitro 動物の使用を回避するためにシステムが広く開発されています。さらに、ヒト細胞の使用は、 in vitro 病態生理学的および治療的調査に関連するモデル。従来の単層(2D)細胞培養は、ある程度ヒト組織を模倣するため広く使用されている。しかし、2D単一培養は人間の器官を模倣することができず、2D単一培養は元の器官の複雑な微小環境を模倣し、模倣する in vivo 状況3,4,5,6.さらに、単層細胞培養では、薬物治療は容易にすべての細胞を破壊/損傷する可能性があります。重要なことに、これらの制限のいくつかは、多層三次元(3D)細胞培養に切り替えることによって克服することができる7,8.実際、3D培養モデルは、細胞の構造、レイアウト、および主要組織における細胞の機能をよりよく反映することが示されています。これらの3D培養は、機能的器官と同様に、様々な細胞株を用いて形成することができる。確かに、3D文化の2つのモデルがあります。1つのモデルは、クラスターを形成し、それらを球体(足場のないモデル)に再編成する集約された細胞の回転楕円体を生成します。第二は、より複雑な構造を有し、器官のミニチュア版と考えられている多臓器特異的細胞の組み合わせで構成されるオルガノイドを生み出す9,10.このため、3D培養システムは、多くの生物学的および臨床的用途を備えた革新的な技術を表しています。したがって、スフェロイドおよびオルガノイドは、再生医療、薬物スクリーニング、および毒物学的研究に関連する疾患モデリングおよび研究に多くの用途を有する6,11,12,13,14,15.3D技術から派生した発がん性スフェロイドは、関連する細胞タイプの形態と表現型を再現し、 in vivo 腫瘍の微小環境、および腫瘍の発達中に作動する細胞通信およびシグナル伝達経路をモデル化する16,17,18.さらに、がん生物学の理解を改善するために、腫瘍スフェロイド/オルガノイドは、潜在的な患者特異的な抗癌療法(個別化)を特定し、その有効性、毒性、および長期的な影響を評価するためにも使用できます。19,20,21,22.球体は、細胞および三次元組織アーキテクチャを維持する能力、模倣する能力のために病態生理学、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを調査する顕著な機会を開いた in vivo 状況、および細胞と細胞の相互作用。しかし、血管/全身性成分の欠如、機能性免疫または神経系などのこのシステムの限界を認識する必要があり、システムは動物モデルと比較して還元主義者のアプローチを表します。実際、動物モデルとは対照的に、3D構造は人体内の生物学の近似のみを提供します。3D法の限界を理解することは、研究者がより大きなスケールで臓器をよりよく表すスフェロイドを生成するためのより洗練された有効なプロセスを設計するのに役立つかもしれません23,24,25.
癌は世界的に主要な死因であり、乳癌は女性26、27、28の中で最も一般的な癌である。乳癌の複雑な微小環境を模倣するために、乳癌スフェロイドは、乳房腫瘍、すなわち上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および/または免疫細胞において顕著な役割を果たす細胞を用いて培養されるべきである。また、乳がんを表すスフェロイドについては、女性ホルモン受容体(エストロゲン/プロゲステロン受容体)の発現、患者腫瘍組織学的状態を保存する能力、および治療に対する応答を模倣する能力も考慮すべきである。研究は、3D共培養系が生体内の一次組織と同様の細胞組織を有し、刺激にリアルタイムで反応する能力を有し、機能的アンドロゲン受容体29、30、31、32を有することを示している。したがって、同様のアプローチは、インビトロで乳房腫瘍を模倣するのに役立つ可能性があります。現在のプロトコルの目的は、乳癌スフェロイドを生成する新しい方法を確立することです。この方法は、エストロゲン受容体陽性MCF-7細胞(上皮細胞の不滅のヒト細胞株)および血管内皮細胞(HUVEC)またはリンパ系内皮細胞(HMVEC-DNeo)を利用して、腫瘍内でこれらの細胞間の相互作用を模倣または密接に反映するモデルを作成する。MCF-7(エストロゲン応答性)および内皮細胞は、本研究においてスフェロイドの開発に用いられてきたが、胸腫瘍質量の約80%を占める線維芽細胞のような他の細胞も、将来的に組み合わせて乳房腫瘍をよりよく発現し、模倣することができる。
例えば、回転楕円体を形成するいくつかの方法があります: 1) 重力33,34を採用する吊り下げ液滴法。2)外部磁石35に曝露された磁気ナノ粒子を用いる磁気浮上法、及び3)低付着プレート36、37に細胞を播種して行うスフェロイドマイクロプレート法。1つの細胞タイプのみを使用する既存の方法に基づいて、本プロトコルは、生体内38、39、40、41における乳癌腫瘍の増殖条件をよりよく模倣するために上皮細胞および内皮細胞を用いて最適化されている。この方法は、低コストで、最小限の機器要件で実験室で簡単に達成することができます。ラボの必要性/目標に基づいて、異なるアプローチがスフェロイドを形成し、これらのスフェロイドから関連する細胞材料を得るために使用されました。この文脈では、DNA、RNA、またはタンパク質解析のために、3Dスフェロイドは、吊り下げドロップ法と内皮細胞と上皮細胞を共培養することによって産生される。しかし、機能研究のために、例えば、短い干渉(siRNA)トランスフェクションおよび/またはホルモン処理後の細胞増殖を監視するために、スフェロイドはU-底板を用いて生成される。
この技術プロトコルの目的は、1)乳癌多細胞型スフェロイドを形成するための詳細なステップバイステップの説明を提供することです, 2) 組織染色のためのサンプルを調製, および 3) RNA, DNA, タンパク質の抽出のための細胞のコレクション.安価な吊り下げ方法と、より高価なU-底板の両方が、スフェロイドを形成するために使用されます。ここでは、細胞増殖、アポトーシス、および上皮細胞および内皮細胞の分布をスフェロイド内で評価するマーカーによる切除とその後の免疫染色のためのスフェロイドを調製(固定)するためのプロトコルが提供される。さらに、このプロトコルは ImageJ ソフトウェアを使用して、組織学的データの完全な段階ごとの分析を示しています。生物学的データの解釈は、実験の種類や使用する抗体によって異なります。固定スフェロイドの切除とセクションのその後の染色は、ルーチン病理実験室(ソフィストラボ:info@sophistolab.ch)
Protocol
Representative Results
Discussion
2D細胞培養と比較して、革新的な3Dスフェロイド培養技術は、臓器の微小環境、細胞間相互作用、およびイン ビトロでの薬物応答を再構築するためのより優れた強力なツールである。これは、乳がん研究のための多細胞(上皮および内皮)細胞株からのスフェロイドの形成を記述する最初のプロトコルである。このプロトコルは、最大5日間のスフェロイドの回転楕円体3D成長を保証し、ス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、がん研究財団/スイス癌連盟がRKDと国立衛生研究所のEKJ助成金DK079307にKFS-4125-02-2017を付与することによって支援されました。
Materials
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
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