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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

O crosstalk entre células epiteliais mamárias e células endoteliais contribui importantemente para a progressão do câncer de mama, crescimento do tumor e metástase. Neste estudo, os esferoides foram feitos a partir de células cancerígenas de mama juntamente com células endoteliais vasculares e/ou linfáticas e demonstram sua aplicabilidade como um sistema in vitro para pesquisa de câncer de mama.

Abstract

O câncer de mama é a principal causa de mortalidade em mulheres. O crescimento das células cancerígenas de mama e sua metástase subsequente é um fator-chave para sua progressão. Embora os mecanismos envolvidos na promoção do crescimento do câncer de mama tenham sido intensamente estudados utilizando monoculturas de células cancerígenas de mama, como as células MCF-7, a contribuição de outros tipos celulares, como células endoteliais vasculares e linfáticas que estão intimamente envolvidas no crescimento do tumor, não tem sido investigada em profundidade. A interação célula-célula desempenha um papel fundamental no crescimento e progressão do tumor. A neoangiogênese, ou o desenvolvimento de vasos, é essencial para o crescimento do tumor, enquanto o sistema linfático serve como um portal para a migração de células cancerígenas e metástase subsequente. Estudos recentes fornecem evidências de que células endoteliais vasculares e linfáticas podem influenciar significativamente o crescimento de células cancerosas. Essas observações implicam a necessidade de desenvolver modelos in vitro que reflitam de forma mais realista os processos de crescimento do câncer de mama in vivo. Além disso, as restrições na pesquisa animal exigem o desenvolvimento de modelos ex vivo para elucidar melhor os mecanismos envolvidos.

Este artigo descreve o desenvolvimento de esferoides de câncer de mama compostos tanto de células cancerígenas de mama (células mcf-7 positivas do receptor de estrogênio) quanto de células endoteliais vasculares e/ou linfáticas. O protocolo descreve uma abordagem detalhada passo a passo na criação de esferoides de células duplas usando duas abordagens diferentes, queda suspensa (padrão ouro e barato) e placas de fundo U de 96 poços (caras). Instruções aprofundadas são fornecidas para como captar delicadamente os esferoides formados para monitorar o crescimento através do dimensionamento microscópico e avaliando a viabilidade usando manchas de células mortas e vivas. Além disso, são delineados procedimentos para fixação dos esferoides para secção e coloração com anticorpos específicos para o crescimento para diferenciar padrões de crescimento em esferoides. Além disso, são fornecidos detalhes para a preparação de esferoides com células transfectadas e métodos para extrair RNA para análise molecular. Em conclusão, este artigo fornece instruções aprofundadas para a preparação de esferoides multicelulares para a pesquisa do câncer de mama.

Introduction

O uso de animais para experimentos tem limitações. Estudos em animais não podem imitar com precisão a progressão da doença em humanos, e animais e humanos não têm respostas idênticas a patógenos. Além disso, restrições na experimentação animal devido a preocupações com o sofrimento animal e problemas éticos1,2 cada vez mais restringe programas de pesquisa. In vitro sistemas têm sido amplamente desenvolvidos para contornar o uso de animais; além disso, o uso de células humanas fez in vitro modelos mais relevantes para a investigação fisiofisiológica e terapêutica. Culturas celulares monocamadas convencionais (2D) são amplamente utilizadas porque imitam tecidos humanos até certo ponto. No entanto, as monoculturas 2D não imitam órgãos humanos, e as monoculturas 2D são incapazes de simular o microambiente complexo dos órgãos originais e imitar o in vivo situação3,4,5,6. Além disso, nas culturas de células monocamadas, os tratamentos medicamentosos podem facilmente destruir/danificar todas as células. É importante ressaltar que algumas dessas limitações podem ser superadas mudando para culturas celulares tridimensionais multicamadas (3D)7,8. De fato, modelos de cultura 3D têm sido mostrados para refletir melhor a estrutura celular, layout e função das células nos tecidos primários. Essas culturas 3D podem ser formadas usando uma variedade de linhas celulares, semelhantes a um órgão funcional. Na verdade, existem dois modelos de culturas 3D. Um modelo produz esferoides de células agregadas que formam clusters e as reorganizam em esferas (modelos livres de andaimes). O segundo produz organoides, que possuem uma estrutura mais complexa e consistem em combinações de múltiplas células específicas de órgãos, que são consideradas como uma versão em miniatura de órgãos9,10. Devido a isso, os sistemas de cultura 3D representam uma tecnologia inovadora com muitas aplicações biológicas e clínicas. Assim, esferoides e organoides têm inúmeras aplicações para modelagem de doenças e estudos relacionados à medicina regenerativa, rastreamento de medicamentos e estudos toxicológicos6,11,12,13,14,15. Esferoides cancerígenos, derivados da tecnologia 3D, recriam a morfologia e o fenótipo de tipos celulares relevantes, imitam o in vivo microambiente tumoral, e modelo de comunicações celulares e vias de sinalização que estão operacionais durante o desenvolvimento do tumor16,17,18. Além disso, para melhorar a compreensão da biologia do câncer, os esferoides/organoides tumorais também podem ser usados para identificar uma potencial terapia anticâncer específica do paciente (personalizada) e avaliar sua eficácia, toxicidade e efeitos a longo prazo19,20,21,22. Esferoides abriram oportunidades proeminentes para investigar a fisiopatologia, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos devido à sua capacidade de preservar a arquitetura celular e tridimensional do tecido, a capacidade de imitar o in vivo situação, e as interações célula-célula. No entanto, deve-se também estar atento às limitações desse sistema, como a falta de componente vascular/sistêmico, sistema imunológico funcional ou nervoso, e o sistema representa uma abordagem reducionista em relação aos modelos animais. De fato, ao contrário dos modelos animais, as estruturas 3D fornecem apenas uma aproximação da biologia dentro de um corpo humano. Entender as limitações do método 3D pode ajudar os pesquisadores a projetar processos mais refinados e válidos para a produção de esferoides que melhor representam um órgão em maior escala23,24,25.

O câncer é a principal causa de morte em todo o mundo, e o câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres26,27,28. Para imitar o complexo microambiente do câncer de mama, os esferoides do câncer de mama devem ser cultivados usando células que desempenham um papel proeminente nos tumores mamários, ou seja, células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos e/ou células imunes. Além disso, para um esferoide representando o câncer de mama, a expressão dos receptores hormonais femininos (receptores de estrogênio/progesterona), a capacidade de conservar o tumor do paciente status histológico e a capacidade de imitar a resposta à terapia também devem ser consideradas. Estudos têm demonstrado que os sistemas de cocultura 3D possuem uma organização celular semelhante à do tecido primário in vivo,têm a capacidade de reagir em tempo real a estímulos, e possuem receptores andrógenos funcionais29,30,31,32. Assim, uma abordagem semelhante poderia ser útil para imitar um tumor de mama in vitro. O objetivo do protocolo atual é estabelecer um novo método de geração de esferoides de câncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 receptores estrógenos positivos (uma linha celular humana imortalizada de células epiteliais) e células endoteliais vasculares (HUVECs) ou células endoteliais linfáticas (HMVEC-DNeo) para criar um modelo que imita ou reflete de perto as interações entre essas células dentro de um tumor. Embora as células MCF-7 (responsivas ao estrogênio) e as células endoteliais tenham sido usadas para desenvolver esferoides no presente estudo, outras células, como os fibroblastos que representam ~80% da massa tumor do mama, também poderiam ser combinadas no futuro para representar e imitar melhor o tumor mamário.

Existem vários métodos para formar esferoides, tais como: 1) o método de gotícula suspensa que emprega a gravidade33,34; 2) o método de levitação magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expostas a um ímã externo35, e 3) o método de microplaca esferoide que é realizado por células semeadas em placas de baixa fixação36,37. Com base nos métodos existentes, que utilizam apenas um tipo de célula, o presente protocolo tem sido otimizado utilizando células epiteliais e endoteliais para melhor imitar as condições de crescimento dos tumores de câncer de mama in vivo38,39,40,41. Este método pode ser facilmente alcançado em laboratório a um baixo custo e com requisitos mínimos de equipamento. Com base na necessidade/objetivos do laboratório, diferentes abordagens foram utilizadas para formar esferoides e obter material celular relevante a partir desses esferoides. Neste contexto, para análise de DNA, RNA ou proteína, os esferoides 3D são produzidos por células endoteliais e epiteliais com o método de queda suspensa. No entanto, para estudos funcionais, por exemplo, para monitorar o crescimento celular após transfecção de interferência curta (siRNA) e/ou tratamento hormonal, os esferoides são gerados usando placas de fundo U.

O objetivo deste protocolo técnico é fornecer uma descrição detalhada passo a passo para 1) formação de esferoides multicelulares do câncer de mama, 2) preparando amostras para coloração histológica e 3) coleta de células para extração de RNA, DNA e proteínas. Tanto o método de queda de suspensão barato quanto as placas inferiores U mais caras são usadas para formar esferoides. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação (fixação) de esferoides para secção e imunostenção subsequente com marcadores para avaliar a proliferação celular, apoptose e distribuição de células epiteliais e endoteliais dentro de um esferoide. Além disso, este protocolo mostra uma análise completa passo a passo dos dados histológicos usando o software ImageJ. A interpretação dos dados biológicos varia dependendo do tipo de experimento e dos anticorpos utilizados. A secção de esferoides fixos e a posterior coloração das seções foram realizadas por um laboratório de patologia de rotina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

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Protocol

1. Cultura celular

NOTA: Conduzir o manuseio da célula em condições estéreis.

  1. Subcultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)
    1. Cubra 75 cm2 frascos com colágeno (5 μg/cm2) (rabo-de-rato) durante a noite (ON) à temperatura ambiente (RT) ou 2-3 h a 37 °C, enxágue com água e deixe o frasco secar.
    2. Crescer HUVECs em meio de crescimento (EBM-2, Endotelial Basal Medium-2) suplementados com glutamina (1x = 2 mM), solução antibiótico-antimicótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina e 0,025 μg/mL de anfotericina B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL de hidrocortisona, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano, 3 ng/mL do fator de crescimento do fibroblasto básico humano, 10 μg/mL de heparina) e 10% FCS (Soro de Bezerro Fetal) em condições padrão de cultura tecidual (37 °C, 5% CO2). Troque o meio a cada 2 dias até que as células atinjam 70%-80% de confluência.
    3. Lave as culturas subcontraentes com 5 mL de HBSS (sem Ca2+ e Mg2+) e adicione 3 mL de trippsina (0,25% diluída em HBSS (sem Ca2+ e Mg2+).
      NOTA: O HBSS também pode ser substituído por PBS.
    4. Incubar as células a 37 °C por 2 min (verificar microscopicamente se as células estão separadas e arredondadas) e parar a reação de desapego adicionando 6 mL de 10% de meio FCS (DMEM-F12 ou EBM-2, 10% FCS).
    5. Centrifugar a suspensão celular a 250 x g por 5 min no RT e descartar o supernascedor.
    6. Suspenda as células em meio de crescimento e sementes em frascos de 75 cm2 ou pratos de cultura.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, células de adenocarcinoma de mama humana) subcultura
    1. Cultivar linhas de células cancerígenas de mama humanas em frascos de 75 cm2 em meio de crescimento (médio DMEM/F12 suplementado com glutamina comercial (1x), solução antibiótico-antimycótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina e 0,025 μg/mL de anfotericina B), e 10% FCS em condições padrão de cultura tecidual (37 °C, 5% CO2). Troque o meio a cada 2-3 dias.
    2. Lave as culturas celulares subconfluentes (70%-80% de confluência) com 5 mL de HBSS (sem Ca2+ e Mg2+) e adicione 3 mL de trippsina (0,5% diluída em HBSS (sem Ca2+ e Mg2+) a 37 °C por 5 min (verifique microscopicamente se as células são separadas).
      NOTA: O HBSS também pode ser substituído por PBS.
    3. Adicione 8 mL de meio FCS de 10% para parar a reação de desapego, centrífuga a 250 x g por 5 min em RT e descarte o supernaspetivo.
    4. Suspenda a pelota em meio de crescimento e placa em frascos de 75 cm2 ou pratos de cultura.

2. Formação esferoide

  1. Placa 5 x 105 células/mL (HUVECs e MCF-7) em um prato redondo de 3,5 cm e cultura por 48 h.
  2. Trate ou transfete as células banhadas por 24 h ou conforme desejado.
  3. Etapa opcional realizada em placa de fundo U de 96 poços: Lave as células com 1 mL de HBSS (Ca2+ e Mg2+) e colora HUVECs usando um corante azul (0,5 μg/mL) e células MCF-7 utilizando um corante verde (0,5 μM) diluídas no respectivo meio de crescimento e colocadas em uma incubadora de CO2 de 37 °C e 5% por 30-40 min.
  4. Lave as células com 1 mL de HBSS (sem Ca2+ e Mg2+),adicione 1 mL de reagente de descolamento enzimático (0,25% trypsin para HUVEC e 0,5% trypsin para MCF-7) a cada prato redondo usando uma pipeta P1000, e depois incubar por 2-5 min até que as células sejam separadas.
  5. Colete cada tipo de célula separadamente em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL e adicione 1 mL de meio FCS 10% usando uma pipeta P1000 para parar a reação enzimática. Centrifugar as suspensões celulares a 250 x g por 5 min.
  6. Aspire cuidadosamente o supernaente e suspenda as células em 1 mL de meio livre de esteroides (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimíctico, 0,4% FCS sf (despojado de carvão)).
    NOTA: O meio sem esteroides pode ser substituído por meio de crescimento normal.
  7. Use 100 μL de cada suspensão celular diluída com 10 mL de Diluente II (ver Tabela de Materiais) para determinar o número total da célula e calcular a quantidade de meio de tratamento (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimicomíntico, 0,4% FCS sf, veículo/Tratamento) necessário para obter uma suspensão celular de 5 x 103 células/mL ou 3,4 x 105 células/mL por tipo de célula.
    1. Contagem celular
      1. Ligue a máquina e lave pressionando os botões Function and Start (configuração S3), com solução Diluent II em um frasco de contador de células.
      2. Use configurar S4 e pressione Comece a medir o branco com a solução Diluent II fresca.
      3. Altere o frasco de cintilação com 100 μL de suspensão celular em 10 mL de solução Diluent II e meça as amostras: configurar S4 e pressionar Start.
      4. Observe o número de células por mL no visor digital.
        NOTA: A contagem de células também pode ser realizada usando outros sistemas manuais ou automáticos: linhas de grade hemocitâmica, tecnologia de contagem de células de dispersão de luz, impedância elétrica, sistemas baseados em imagens usando coloração celular, por exemplo, azul trypan.
    2. Placas de fundo U de 96 poços
      1. Prepare 5 mL de cada suspensão celular (5 x 103 células/mL) e misture-as para obter um volume final de 10 mL na proporção de 1:1.
      2. Use uma pipeta de repetição manual para pipeta de 100 μL da suspensão da célula em cada poço das placas inferiores U de 96 poços.
      3. Coloque a placa em uma incubadora em condições padrão de cultura tecidual e verifique se há formação de esferoides após 48 h.
      4. Passo opcional: Tire fotos dos esferoides (40x) usando um microscópio estéreo de fluorescência.
        NOTA: Este método gera 96 esferoides (um esferoide/bem) após 48 h (área 1-2 pixel2), e geralmente é usado para estudos de crescimento.
    3. Queda de enforcamento
      1. Misture as suspensões celulares (3,4 x 105 células/mL) em uma proporção de 1:1 para obter um volume final de 2 mL.
      2. Use uma pipeta P20 para semear a mistura celular na forma de gotas de 15 μL na tampa invertida de uma placa de Petri de 10 cm.
      3. Inverta a tampa com as gotas e adicione 5 mL de meio base (EBM-2) na parte inferior do prato para evitar a evaporação das gotas.
        NOTA: Este método gera um esferoide/queda após 48 h. Certifique-se de que as gotas estão suficientemente separadas umas das outras, para que elas não se fundam ao trocar a tampa. Use mais de uma placa de Petri de 10 cm, se necessário.

3. Estudo de crescimento esferoide

  1. Placa 100 μL de HUVECs e mistura de células MCF-7 (5 x 102 células/bem) em placas de fundo U de 96 poços e colocá-los na incubadora.
  2. 48 h após o revestimento, verifique se há formação de esferoides com um microscópio invertido (campo brilhante). Tire fotos (pelo menos seis fotos por tratamento, 40x) a 96 h de cultura.
  3. Abra as imagens usando um software de processamento de imagem e processe a imagem a 300 pixels/polegada e salve a imagem como um arquivo de tiff.
  4. Baixe o software ImageJ e abra-o. Clique na opção Arquivo e vá para Abrir.
  5. Converter as áreas de interesse em áreas negras saturadas de forma uniforme para ter uma imagem binária (preto e branco). Para isso, selecione a opção Imagem, escolha Digite | de 8 bits. Agora, a imagem é em preto e branco.
  6. Use a Ferramenta de Seleção à Mão Livre para desenhar a borda dos esferoides.
  7. Para calcular a área de interesse e separar o objeto ou os pixels do primeiro plano dos pixels de fundo, use a função limiar: Selecione a opção Imagem, escolha Ajustar e clicar em Limiar.
  8. Agora uma janela pop-up Threshold será aberta. A barra superior indica o valor mínimo do limiar: defina o valor em zero. A barra inferior indica o valor máximo do limiar: mova a barra até que a área de interesse fique completamente vermelha.
    NOTA: Se a cor não estiver vermelha, selecione Vermelho na janela Limiar.
  9. Vá para Analisar | Definir medidas e selecionar Área e Perímetro.
  10. Para medir a área de interesse, selecione a opção Analisar e use a ferramenta Analisar partículas. Na janela Analisar partículas, defina o Tamanho para medir (0,00003-Infinito ou 3-Infinito, dependendo do tamanho dos esferoides), selecione Resumo e Resultados de Exibição. Em seguida, clique em OK.
  11. Os resultados aparecerão em um gráfico. Copie as medições em uma planilha para analisar os dados.
    NOTA: A área é calculada como o número de pixels totais; usar a Área Total para cálculo.

4. Estudo de imunohistoquímica spheróide

  1. Preparação da amostra
    1. Aplaque a mistura celular de HUVECs e MCF-7 (5 x 103 células/bem) em placas de fundo U de 96 poços em meio de crescimento HUVEC por 96 h.
    2. Colete aproximadamente 50 esferoides em um tubo de 1,5 mL com uma ponta de corte de uma pipeta P200 μL; permitir que eles se acomodem na parte inferior do tubo pela gravidade, e depois descartar o supernatante.
    3. Fixar os esferoides com 500 μL de 4% PFA por 1 h, RT.
    4. Ferva 2% da solução Nobel Agar em PBS usando uma placa quente com um agitador magnético por 3-5 minutos para dissolver completamente o pó de agarose e esfriar até cerca de 60 °C.
    5. Remova o PFA com uma pipeta P1000, lave os esferoides com 500 μL de PBS e deixe-os sedimentares. Descarte o supernatante.
    6. Pipeta cuidadosamente 600 μL de solução agarose no tubo de 1,5 mL com esferoides e coloque o tubo imediatamente em uma centrífuga com um rotor horizontal a 177 x g por 2 min.
    7. Adicione uma corda curta no meio da solução agarose para remover facilmente o plugue do tubo.
    8. Solidificar agarose plug no gelo ou a 4 °C. Adicione 500 μL de PBS no tubo de 1,5 mL para evitar secar a pelota.
      NOTA: As amostras estão prontas para posterior desidratação, incorporação de parafina, secção, transferência para os slides do microscópio e coloração de IHC (realizada pelo Sophistolab).
  2. Aquisição e processamento de imagens
    1. Adquira imagens de seções esferoides usando um estereótipo.
    2. Salve três imagens para cada amostra à medida que .jpg arquivos.
    3. Abra o software ImageJ. Abra a imagem JPEG, clique em Arquivo e, em seguida, em Abrir.
    4. Selecione Desconvolução de cores e cores na opção Imagem.
    5. Selecione vetores H DAB na janela Deconvolução de cores 1.7 e as três imagens aparecem.
      NOTA: As três imagens são: A cor 1 representa apenas a mancha de Hematoxilina (azul/roxo), e a Cor 2 representa apenas a coloração DAB (marrom). A cor 3 não é necessária para a análise da imagem com duas manchas.
    6. Selecione a janela Cor 1 e defina o Limiar: vá para Imagem | Ajuste e clique em Limiar. A janela Limiar aparece.
    7. Deixe o valor mínimo do limiar definido em zero e ajuste o valor máximo do limiar para remover o sinal de fundo sem influenciar o sinal verdadeiro. Clique em Aplicar.
      1. Medição da área
        1. Clique em Analisar,escolha definir medição. Selecione Área, Valor cinza Médioe valor cinza Min e Max e clique em OK para confirmar.
        2. Meça o tamanho do núcleo usando a opção Analisar e selecione Medir.
          NOTA: A janela Resultados dá o nome da imagem (Rótulo), tamanho da imagem (Área), a intensidade média do pixel da imagem IHC (Média) e os valores cinzentos mínimos e máximos (Min, Max). Use o valor médio para cálculo.
        3. Repetir as etapas 4.2.6-4.7.1.2 para a janela Cor 2 (e Cor 3 se houver coloração dupla).
      2. Quantificação celular
        1. Clique em Processar,escolha a opção Binário e selecione Watershed para separar células.
        2. Vá para Analisar e clique em Analisar partículas. Na janela de pop-up Analyze Particles, defina o tamanho das células para excluir partículas inespecíficas. Em seguida, na opção Mostrar, clique na caixa de entrega e selecione Contornos. Em seguida, clique em OK.
        3. Repetir as etapas 4.2.6-4.2.7 e as etapas de quantificação celular (seção 4.2.7.2) para a janela Cor 2 (e Cor 3, se houver coloração dupla).
          NOTA: Agora aparecerão três janelas: 1) Resultados sumários (número de células contadas, área total, tamanho médio, % de área e média), 2) Resultados (respectivos para as células que são contadas) e 3) Janela de desenho (imagem retratada das células que são contadas).

5. Manchas vivas/mortas em Esferoides

  1. Prepare 4 mM soluções de estoque de Calcein AM em DMSO (manchas vivas verdes) e 2 mM de homodimer de Ethidium em DMSO (manchas de células mortas vermelhas) em tubos de 1,5 mL.
  2. Calcule a quantidade de solução necessária para adicionar 10 μL/poço de uma mistura de Calcein AM e Ethidium homodimer diluído 1:50 em EBM-2.
  3. Adicione a mistura de coloração aos esferoides e coloque a placa na incubadora em condições padrão de cultura tecidual por 30-60 min.
  4. Adquira imagens (40x) usando o microscópio estéreo fluorescência.

6. Isolamento da proteína e do RNA de Spheroid

  1. Prepare as suspensões celulares a 3,4 x 105 células/mL por tipo de célula, misture-as a uma razão de 1:1 e semee a mistura celular usando uma pipeta P20 na forma de gotas de 15 μL na tampa de uma placa de Petri de 10 cm. Inverta a tampa e coloque-a na incubadora em condições padrão de cultura tecidual por 96 h.
  2. Use 5-6 mL de PBS para coletar esferoides em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 15 mL usando pipetas de poliestireno estéreis de 5 mL.
    NOTA: Também é possível usar tubos cônicos de 15 mL.
  3. Centrifugar a suspensão dos esferoides a 250 x g por 5 min e, em seguida, aspirar cuidadosamente o supernatante.
  4. Adicione 500 μL de trippsina (100%) e pipeta para cima e para baixo usando uma pipeta P1000 por 30 s para desagregar esferoides, conseguindo uma suspensão celular.
  5. Neutralizar trippsina com 10% de meio FCS, centrifugar os tubos a 250 x g por 5 min, e aspirar o supernante.
  6. De acordo com o protocolo do fabricante (kit específico para isolamento de RNA sem DNA), use 300 μL de tampão de RNA para lise a pelota celular.
    NOTA: O tampão de lise também pode ser adicionado diretamente aos esferoides intactos (sem necessidade de etapa de trippsina) para extrair RNA. Adicione 300 μL do tampão de lise aos esferoides pelleted, coloque tubos no gelo e tritura 10 vezes usando uma pipeta P200. Posteriormente, isole o RNA como acima. A dissociação esferoide pode ser necessária se a recuperação do RNA for baixa devido à interferência matricial.
  7. Alternativamente, use 70 μL do tampão de lise para isolamento de proteínas. Homogeneize para 2-4 s por sônica e determine a concentração de proteína de acordo com o protocolo do fabricante usando um Kit de Ensaio BCA.
    NOTA: Para o isolamento da proteína, os esferoides pelleted podem ser diretamente lysed em tampão de lise seguido de sonicação. Use 25 μg de proteína total para realizar a mancha ocidental.

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Representative Results

O modelo de esferoides usando coculturas epiteliais e endoteliais é necessário para imitar de perto as condições in vivo dos tumores mamários para experimentos in vitro. O esquema na Figura 1 retrata o protocolo para formar esferoides com células epiteliais de câncer de mama e células endoteliais vasculares ou linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula é semeada separadamente em um prato redondo de 3,5 cm e tratada com estimuladores/inibidores de crescimento ou transfeccionadas com oligonucleotídeos usando Lipofectamina. As monocamadas confluentes de células epiteliais ou endoteliais são colhidas após a trippsinização, lavadas e misturadas a uma razão de 1:1. As células são posteriormente banhadas em placas de fundo U de 96 poços (Figura 1A) ou na tampa invertida de um prato de cultura redonda de 10 cm de diâmetro para facilitar a cultura de queda de suspensão(Figura 1B). Logo após a semeadura, as células aparecem como folhas planas e densas de células na parte inferior de cada poço ou queda, e, posteriormente, elas se agregam com o tempo (24-48 h), formando assim esferoides intactos a 48 h. Para evitar qualquer dano aos agregados celulares soltos, as placas não devem ser perturbadas por pelo menos 24 h.

Em placas de fundo U, a semeadura de células MCF-7, mas não células endoteliais ou células linfáticas, resultou em formação de esferoides após 48 h(Figura 2A, B,respectivamente). Além disso, a semeadura de células endoteliais ou células linfáticas de MCF-7 ou células linfáticas em uma razão de 1:1 também resultou na formação de esferoides(Figura 2C, D, respectivamente). Para validar os esferoides como modelo para estudar o crescimento do tumor, foram medidas/quantificadas alterações no tamanho do spheroid em resposta à solução estimulante do crescimento/quantificadas e comparadas com os controles não tratados(Figura 2). Fotomicrografos na Figura 2E mostram o crescimento sequencial dependente do tempo (24-120 h) de um esferoide MCF-7 representativo. O gráfico de linha na Figura 2F retrata a mudança na área de esferoides MCF-7 ao longo do tempo quando tratados com ou sem um estimulador de crescimento. O tamanho do esferoide aumentou de ~100 μm para ~200 μm ao longo de 5 dias; além disso, observou-se aumento da taxa de crescimento em esferoides tratados com o estimulador de crescimento (Figura 2F). Como o tratamento a longo prazo (168 h) resultou na redução da viabilidade do MCF-7, potencialmente devido a condições hipóxiis no centro dos esferoides(Figura 3),o crescimento da estrutura 3D foi estudado até 96 h. Spheroids formados com células MCF-7 e HUVECs mostram um número menor de células mortas a 168 h em comparação com esferoides formados apenas com MCF-7.

Nos experimentos iniciais, apenas um pequeno crescimento no tamanho dos esferoides foi observado após 4 dias de cultura. Foi a hipótese de que isso poderia ser devido ao alto número de células semeadas para formar esferoides. Nas placas de cultura do fundo U, o crescimento dos esferoides poderia ter sido limitado pela forma côncava do poço. Como o crescimento dependia do número inicial de células semeadas, diferentes números de células foram usados para formar esferoides para testar e estabelecer condições que seriam ideais para monitorar o crescimento esferoide. Como mostrado na Figura 4,os achados sugerem que, para estudos de crescimento esferoides, a semeadura de 500 células/poço para formar esferoides foi confiável e reprodutível para o monitoramento do crescimento dos spheróides por 4-6 dias em resposta a fatores moduladores de crescimento. Esferoides mais adequados para observações histológicas ou imuno-histológicas foram obtidos no dia 4, após semeadura de 5 x 103 células/bem. Esta mesma concentração inicial foi utilizada para extrações de proteína celular ou RNA. O aumento da concentração celular inicial em mais de 7,5 x 103 células/poço não melhorou a formação de esferoides, e as células não se agregaram adequadamente e assumiram estruturas irregulares(Figura 4).

Para avaliar a composição celular, a proliferação e o estado da apoptose, seções histológicas de esferoides formados com células cancerígenas de mama mais células endoteliais foram examinadas utilizando anticorpos H&E e Ki67 (diluição 1:300) e Caspase-3 (diluição 1:500). O processo de preparação final da amostra requer cuidado/atenção e precisão. A Figura 5A retrata o fluxo de trabalho para a coleta e incorporação de esferoides em agarose para secção. Fotomicrogramas na Figura 5B-C demonstram a diferença na formação de esferoides MCF-7 na presença ( Figura5B) e ausência(Figura 5C) da Lipofectamina (concentração final de 0,17), um agente de transfecção comumente utilizado. Imagens microscópicas de campo brilhante de seções histológicas mostram uma estrutura circular e compacta de uma mistura homogênea de dois tipos de células(Figura 5D-G). A estrutura dos esferoides e a forma de suas células não apresentaram anormalidades após a transfecção com oligonucleotídeos de controle na presença de Lipofectamina(Figura 5D). Além disso, as células que expressavam o marcador proliferativo, Ki67, foram distribuídas de forma homogênea nos esferoides; no entanto, também foi observado um anel de células proliferativas na superfície dos esferoides(Figura 5E). A coloração do Caspase-3 mostrou células apoptóticas após 4 dias de cultura(Figura 5F). Seções histológicas são úteis para avaliar a distribuição de células epiteliais e endoteliais em esferoides usando marcadores específicos. Usando o CD31 como um marcador específico para células endoteliais, é possível determinar sua distribuição dentro da estrutura 3D. Uma vez que todas as células estão manchadas com Hematoxilina (coloração azul do núcleo da célula), o cálculo da expressão CD31 poderia fornecer a área dos esferoides contendo células endoteliais após o tratamento ou transfecção (seção de protocolo 4.2.7.1.). Além disso, ao realizar um ensaio de coloração dupla, é possível ter ainda mais informações, por exemplo, como mostra a Figura 5G, CD31 manchas células endoteliais (vermelha) e Ki67 manchas células proliferativas (marrom). Seguindo o protocolo seção 4.2.7.2, a Figura 5G revelou que 55% são células epiteliais, 45% são células endoteliais e 25% das células estão proliferando.

A estrutura dos esferoides também pode ser estudada utilizando a análise de imunofluorescência após a rotulagem de células com corantes vivos. As culturas 2D confluentes das células HUVEC e MCF-7 foram separadamente manchadas com corantes azuis (HUVEC) e verdes (MCF-7). Posteriormente, as células manchadas foram coletadas e misturadas a uma razão de 1:1 e semeadas em poços para formação de esferoides. Imagens de células fluorescentes manchadas foram tiradas imediatamente após a semeadura(Figura 6A) e após 3 dias de cultura(Figura 6B). Com o objetivo de avaliar a porcentagem de células vivas e mortas, os esferoides de 4 dias de idade foram manchados com calceíno-AM (verde) e com homodimer de ethidium (vermelho)(Figura 6C). Os spheroids formados com MCF-7 e HUVECs não poderiam ser congelados/preservados com sucesso usando os protocolos padrão para células de congelamento (meio de crescimento suplementado com 10% DMSO e 10% FCS) para células de congelamento. Em esferoides congelados e descongelados, a ruptura dos agregados celulares e o aumento da perda de viabilidade celular foram evidentes. A imagem representativa na Figura 6D mostra um esferoide recém-descongelado manchado para células mortas e vivas. Mostra que os esferoides são muito sensíveis às condições de congelamento.

Após 5 dias de cultura em condições experimentais, a lise de cerca de 100 esferoides foi necessária para coletar proteína suficiente (~3 μg/mL) ou RNA (~60 ng/μL) para análise. A Figura 7 representa um fluxo de trabalho desde a coleta de esferoides (gerado com o método de gotas penduradas) até a lise celular para extração de proteínas para realizar manchas ocidentais ou isolamento de RNA para futuros ensaios ou análises de Microarray por RT-PCR. O isolamento do RNA/DNA de uma população celular heterogênea em um esferoide para análise de microarray pode trazer algumas informações úteis. No entanto, para identificar mecanismos específicos de células-chave ou interações célula-células, as células esferidas podem ser separadas após dissociação enzimática (trypsin ou accutase), usando análise FACS e RNA de células específicas usadas para análise de microarray. Além disso, linhas celulares resistentes a antibióticos (por exemplo, usando linhas celulares de resistência e/ou puramicina) poderiam ser usadas em eferóides para abordar o papel de um tipo específico de interação célula-célula. Além disso, ferramentas de silenciamento genético podem ser usadas para projetar as células para resolver problemas específicos de interação célula-célula.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho da formação de esferoides. As células MCF-7 e HUVEC ou LEC em culturas 2D são cultivadas separadamente e coletadas após vários tratamentos desejados. Os esferoides são posteriormente gerados pela mistura direta de células em (A) 96-well placas de fundo U, que promovem a formação de estrutura 3D por agregação célula-célula, ou usando (B) cultura de queda suspensa que suporta a formação de spheroids através da força da gravidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Formação e desenvolvimento esferoides ao longo do tempo. As imagens retratam a formação de um esferoide por células MCF-7(Painel A),a falta de formação eferóide por células endoteliais ou linfáticas (HUVECs; (Painel B)) banhado na mesma densidade, e formação de esferoides por células MCF-7 mais HUVECs ou LECs misturados a uma razão de 1:1(Painéis C,D). Também é representado o crescimento em tamanho de um esferoide ao longo do tempo (24h, 48h, 72 h, 96 h e 120 h). Este esferoide foi formado a partir de uma mistura de MCF-7 mais HUVECs em uma proporção de 1:1 e semeado a uma densidade de 500 células/poço de uma placa de fundo U de 96 poços(Painel E),(barra de escala = 200 μm, 40x). O gráfico de linha (Painel F) mostra o crescimento do controle dependente do tempo (CTR) versus esferoides estimulados pelo crescimento (Tratamento). As áreas de Spheroid foram medidas e comparadas entre esferoides não tratados e tratados. Os resultados representam ± SEM, *** p < 0,001 em comparação com o respectivo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Spheroids cultura de longo prazo e viabilidade. O fotomicrograma mostra a viabilidade celular em esferoides formados apenas com células MCF-7 a 96 h(Painel A) e 168 h(Painel C),enquanto os painéis B e D retratam a viabilidade celular em s esferoides feitos com MCF-7 mais HUVECs (proporção 1:1) a 96 h(Painel B) e 168 h(Painel D) (barra de escala = 100 μm). As células estavam manchadas com Calcein (células vermelhas e mortas) e homodimer de Ethidium (células vivas verdes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Densidade de semeadura celular e perfil de crescimento dependente do tempo do Esferoide MCF-7 mais HUVEC. As células HUVECs e MCF-7 misturadas a uma proporção de 1:1 foram semeadas em densidades crescentes (102-104 células/bem), e o crescimento de esferoides foi monitorado ao longo de 24-96 h. Imagens microscópicas de campo brilhante foram tiradas (barra de escala = 200 μm, 40x) para avaliar o crescimento esferoide ao longo do tempo. Células a uma densidade de 500 células/bem forneceram tamanho ideal para estudar o crescimento esferoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Esferoide incorporando para secção e coloração histológica. Painel A: Desenho animado retratando o fluxo de trabalho para coleta e incorporação de esferoides HUVECs/MCF-7 em agarose. Após a incorporação de parafinas dos esferoides em um plugue de ágarose e secção de blocos de parafina, as amostras foram usadas para coloração histológica padrão. Os painéis B e C mostram o representante MCF-7 mais spheroids HUVEC tratados sem e com Lipofectamina 2000, respectivamente (barra de escala = 200 μm, 40x). Painéis D-G mostram imagens representativas de seções esferoides manchadas com marcadores específicos. O painel D mostra esferoides manchados com hematoxilina-eosina para avaliar a estrutura esferoide (barra de escala = 100 μm). A coloração no Painel E mostra células proliferando positivamente manchadas com Ki67. O painel F mostra células apoptóticas em um esferoide positivamente manchado com Caspase-3 Cleaved (barra de escala = 50 μm). O painel G retrata seções esferoides com coloração dupla: CD31 (marcador de células endoteliais) e Ki67 (marcador proliferativo) (barra de escala = 100 μm). A secção de esferoides e manchas foram realizadas pelo Sophistolab (info@sophistolab.ch). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Imagens de fluorescência de esferoides MCF-7/HUVEC mostrando distribuição celular e viabilidade. Os painéis A e B retratam esferoides representativos com HUVECs manchados com um corante azul e células MCF-7 manchadas com um corante verde. A localização do HUVEC e MCF-7 dentro do esferoide varia imediatamente após a semeadura (A) e após a formação de esferoides(B) (barra de escala = 250 μm). Painéis C-D mostram esferoides manchados com Calcein/Ethidium Homodimer para identificar células vivas (verdes) e mortas (vermelhas) nas estruturas 3D em condições normais de cultura(C) e após o congelamento(D) (Barra de escala = 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Representação esquemática da coleta de esferoides para análise bioquímica. Desenho animado mostrando o esquema de colheita de esferoides, células separadas ou liberadas, e suspendê-los em solução de lise para análise de proteínas ou extração de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Em comparação com as culturas celulares 2D, a revolucionária tecnologia de cultura esferoide 3D é uma ferramenta melhor e mais poderosa para reconstruir o microambiente de um órgão, interações células-células e respostas medicamentosas in vitro. Este é o primeiro protocolo que descreve a formação de esferoides a partir de linhas celulares multicelulares (epiteliais e endoteliais) para a pesquisa do câncer de mama. Este protocolo garante o crescimento 3D esferoidal de esferoides por até 5 dias, e os esferoides podem ser examinados após a incorporação, secção e coloração histológica. Curiosamente, os elementos celulares dentro do esferoide ainda expressam receptores que promovem o crescimento celular e respondem a estímulos proliferativos e apoptóticos. O protocolo descrito gera material biológico suficiente para análise de proteínas ou RNA/DNA. O sistema de cocultura acima, facilmente alcançado em condições laboratoriais e a baixo custo, pode ser uma vantagem para aplicações futuras, especialmente na terapia contra o câncer de mama e para testes de sensibilidade a medicamentos. Além disso, este protocolo pode ser aplicado a diferentes tipos de células epiteliais e endoteliais.

É extremamente difícil imitar in vitro um tecido complexo que existe in vivo. Isso porque os tecidos in vivo consistem em muitos componentes interajantes, incluindo nervos, vasos sanguíneos, mesenquime e células imunes30,42. O objetivo deste protocolo é superar algumas dessas limitações usando um sistema de cocultura 3D com dois tipos de células diferentes para abordar o estado tumoral real. Aqui, os esferoides foram formados com células tumorais epiteliais em combinação com células endoteliais ou células linfáticas para imitar a situação in vivo tanto quanto possível, incluindo interações células celulares, suscetibilidade a fatores apoptóticos liberados nos espaços intercelulares pelas células moribundas, e condições hipóxicas no centro dos esferoides. Este protocolo foi otimizado para testes de respostas celulares a fatores de crescimento, fatores de sinalização e hormônios, que ativam rapidamente cascatas de sinalização e transcrição genética alvo e estimulam a expressão e transporte de proteínas30,31. Em esferoides, mas não in vivo,as respostas das células tumorais aos estímulos podem ser avaliadas de forma rápida e frequente.

No presente estudo, as células endoteliais nos eferóides não parecem formar estruturas capilares. Uma vez que as células endoteliais têm sido mostradas para formar capilares quando banhadas em baixa densidade e monocamadas em alta densidade, é viável que a redução da razão mcf-7 para células endoteliais pode resultar em formação capilar dentro dos esferoides. Alternativamente, a adição de proteínas matriciais específicas ou matrigel pode promover a formação capilar. A falta de estrutura capilar no esferoide não dilui a vantagem do MCF-7 mais células endoteliais versus células MCF-7 em si, pois os fatores liberados pelas células MCF-7 poderiam promover a proliferação celular endotelial e vice-versa; tais interações permaneceriam indesperáveis apenas em esferoides mcf-7.

Vários estudos mostraram que 5 x 103 células/bem foi a concentração adequada às células de sementes para formar esferoides43,44,45,46,47; no entanto, em placas de fundo U de 96 poços, esse número de células limitou o crescimento coordenado de esferoides em condições experimentais. Portanto, a cada novo estudo, para cada novo tipo de célula, é importante monitorar o crescimento do sistema 3D após o tratamento medicamentoso, para determinar os efeitos do tratamento sobre o tamanho do esferoide.

A limitação do protocolo atual é que a cultura de esferoides previamente formados não pode ser continuada após o congelamento e descongelamento pelo método clássico de DMSO. Na verdade, quando descongeladas, a maioria das células estavam mortas. A vitrificação pode ser uma alternativa para manter as células vivas48.

É necessário ter cuidado com os detalhes técnicos para evitar erros e produzir e manter esferoides bem formados. Um desafio é a preparação amostral para imunostaining (seção 4.1). Para facilitar a transferência, canalizando os esferoides no tubo de 1,5 mL, é importante usar uma ponta P200 cortada com tesouras de tal forma que a área do orifício seja maior que os próprios esferoides. Caso contrário, a transferência poderia destruir as esferas. Outro desafio é como aspirar o meio depois que os esferoides se estabelecerem no fundo de um tubo de ensaio. A este respeito, é melhor usar uma pipeta P1000 em vez de uma bomba de vácuo para evitar a aspiração de esferoides. Um passo importante e delicado na preparação dos esferoides para secção é adicionar a agarose aos esferoides pelleted. Os spheróides, uma vez suspensos em agarose, devem ser pelotados rapidamente para o fundo do tubo de microfuge usando centrifugação horizontal à temperatura ambiente e antes que a agarose polimerize.

No geral, o esferoide de duas células feito de células MCF-7 e endotelial fornece uma alternativa viável para investigar interações células-células e mecanismos que impulsionam o crescimento de células cancerosas ou células endoteliais dentro de um tumor. Os esferoides poderiam servir de modelo para avaliar a eficácia de agentes terapêuticos voltados para o crescimento de tumores ou câncer. É importante ressaltar que esse modelo de duas células poderia ser improvisado para incluir outros tipos de células relevantes no crescimento do tumor. Nesse contexto, podem ser incluídos fibroblastos que constituem 80% da massa tumoral mamária para formar um MCF-7, células endoteliais e esferoid fibroblasto. Além disso, o silenciamento genético e as células geneticamente modificadas poderiam ser usados para abordar o papel da interação celular-celular, receptores hormonais (estrogênio/progesterona), fatores de crescimento e caminhos de sinalização no crescimento do tumor/câncer, bem como para testar a eficácia de novas moléculas anticânculares.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 para rkd e National Institute of Health grant DK079307 to EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

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Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in <em>vitro</em> potencial funcional para pesquisa de câncer de mama
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Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

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