Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

Summary

DNA-methyltransferaser er potentielle kræftlægemiddelmål. Her præsenteres en protokol til vurdering af små molekyler til DNA-methyltransferasehæmning. Dette assay anvender en endonuklease til at koble DNA-methylering til fluorescensgenerering og gør det muligt at overvåge enzymaktivitet i realtid.

Abstract

DNA-methylering, en form for epigenetisk genregulering, er vigtig for normal cellulær funktion. I celler etablerer og opretholder proteiner kaldet DNA-methyltransferaser (DNMT’er) DNA-methyleringsmønsteret. Ændringer i det normale DNA-methyleringsmønster er forbundet med kræftudvikling og progression, hvilket gør DNMT’er potentielle kræftlægemiddelmål. Således er identifikation og karakterisering af nye små molekylehæmmere af disse enzymer af stor betydning. Dette papir præsenterer en protokol, der kan bruges til at screene for DNA-methyltransferasehæmmere. Det kontinuerlige koblede kinetikassay gør det muligt at bestemme initialhastigheder af DNA-methylering i nærvær og fravær af potentielle små molekylehæmmere. Analysen bruger den methylfølsomme endonuklease Gla I til at koble methylering af et hemimethyleret DNA-substrat til fluorescensgenerering.

Dette kontinuerlige assay gør det muligt at overvåge enzymaktivitet i realtid. Gennemførelse af analysen i små mængder i mikrotiterplader reducerer omkostningerne ved reagenser. Ved hjælp af dette assay blev der udført en lille eksempelskærm for hæmmere af DNMT1, det mest rigelige DNMT-isozym hos mennesker. Det stærkt substituerede anthraquinon naturlige produkt, laccainsyre A, er en potent, DNA-konkurrencedygtig hæmmer af DNMT1. Her undersøger vi tre potentielle små molekylehæmmere – anthraquinoner eller anthraquinonlignende molekyler med en til tre substituenter – i to koncentrationer for at beskrive analyseprotokollen. Indledende hastigheder bruges til at beregne den procentvise aktivitet, der observeres i nærværelse af hvert molekyle. En af tre undersøgte forbindelser udviser koncentrationsafhængig hæmning af DNMT1-aktivitet, hvilket indikerer, at det er en potentiel hæmmer af DNMT1.

Introduction

DNA-methylering er et vigtigt epigenetisk mærke, der regulerer genekspression og kromatinstruktur. Methylering forekommer overvejende i CpG-dinukleotider – cytosin efterfulgt af guanosin; methylgruppen tilsættes til 5-positionen af cytosin. Korrekte DNA-methyleringsmønstre og dermed korrekt genekspression er nødvendige for passende cellulær udvikling og funktion. Mange sygdomstilstande har været forbundet med ændringer i det normale methyleringsmønster ^1,2,3. For eksempel er der en sammenhæng mellem kræftinitiering og progression og ændringer i DNA-methyleringsmønsteret. Typisk udviser kræftceller lavere samlede niveauer af methylcytosin, hvilket bidrager til genom ustabilitet. Samtidig er methylcytosinet, der er til stede i genomet, koncentreret i promotorregionerne af tumorundertrykkende gener, hvilket fører til genhæmning af disse vigtige proteiner. Især er epigenetiske ændringer dynamiske og reversible, i modsætning til DNA-mutationerne forbundet med tumorigenese. Dette har gjort proteinerne involveret i epigenetisk genregulering interessante lægemiddelmål ^2,4.

DNA-methyltransferaser (DNMT’er) er de proteiner, der er ansvarlige for at generere og opretholde DNA-methyleringsmønstre. Tre katalytisk aktive isozymer, DNMT1, DNMT3a og DNMT3b, findes hos mennesker. Under udvikling og differentiering etablerer de novo methyltransferaserne, DNMT3a og DNMT3b, methyleringsmønstre. Begge enzymer kan binde det katalytisk inaktive DNMT3L-protein til dannelse af komplekser, der udviser øget aktivitet ^1,5. Efter celledeling indeholder datterceller hemimethyleret DNA – DNA indeholdende methylcytosin i kun en streng af duplexet – fordi det nyligt syntetiserede DNA er blottet for methyleringsmærker. DNMT1’s vigtigste funktion er at methylere dette hemimethylerede DNA og dermed genetablere det fulde methyleringsmønster ^1,5.

Forbindelser mellem DNMT-aktivitet og kræft er veletablerede. Overekspression af DNMT1, enten ved transkriptionelle eller posttranslationelle mekanismer, er en konsekvens af flere almindelige onkogene veje 6,7,8,9. Genetiske tilgange til lavere DNMT1-aktivitet ved hjælp af hypomorfe alleler resulterer i nedsat tumordannelse i Apc ^(Min) mus¹⁰. Antisense oligonukleotider, der knockdown DNMT1 hæmmer neoplasi i cellekultur og musetumormodeller^11,12. Således virker hæmning af DNMT1-aktivitet som en lovende tilgang til kræftbehandling. De roller, som DNMT3 isozymer spiller, er dog ikke så ligetil. DNMT3a mutationer findes i akut myeloid leukæmi¹³ og myelodysplastisk syndrom¹⁴. Mindst en af de identificerede mutationer har vist sig at mindske DNA-methyleringsaktiviteten af enzymet¹⁵. DNMT3b er imidlertid overudtrykt i brystkræft¹⁶ og kolorektal cancer¹⁷. Da de forskellige DNMT-isozymer spiller forskellige roller i carcinogenese, vil identifikation af isozymespecifikke hæmmere være kritisk. Ikke alene vil disse forbindelser være nyttige til udvikling af terapi, men isozymspecifikke hæmmere ville også være et uvurderligt redskab til at dissekere hver DNMT-isozyms rolle i kræftetiologi.

Flere DNMT-hæmmere er blevet rapporteret i litteraturen. Kendte DNMT-hæmmere kan opdeles i to klasser: nukleosid og ikke-nukleosid. Nukleosidhæmmere er typisk cytidinanaloger. Disse forbindelser er inkorporeret i DNA og kovalent fælde DNMT’er. 5-azacytidin og 5-aza-2′-deoxycytidin er blevet godkendt til behandling af myelodysplastisk syndrom og akut myeloid leukæmi ^4,18. Den høje toksicitet, lave biotilgængelighed og kemisk ustabilitet af disse forbindelser udgør problemer. Igangværende arbejde undersøger effektiviteten af den næste generation af nukleosidhæmmere; SGI-110, afledt af 5-aza-2′-deoxycytidin, er et eksempel ^19,20. Nukleosidhæmmere er ikke isozymespecifikke og vil inaktivere ethvert DNMT-isozym, der opstår. Derfor resulterer behandling med et nukleosid-demethyleringsmiddel i udtømning af alle DNMT-isozymer ^4,18. Ikke-nukleosidhæmmere behøver ikke at blive inkorporeret i DNA for at udøve deres hæmmende virkninger. I stedet binder disse molekyler direkte til DNMT’er, hvilket introducerer muligheden for isozymspecifik hæmning. Flere ikke-nukleosidhæmmere er blevet opdaget til dato, herunder SGI-1027²¹, hydralazin 22, procainamid 23, RG108 og derivater 24 og naturlige produkter, (-)-epigallocatechin 3-gallat (EGCG)25 og laccainsyre A ^26,27. De fleste af de ikke-nukleosidhæmmere, der er opdaget til dato, er ikke isozymeselektive eller viser svage præferencer for et DNMT-isozym. Derudover skal styrken af disse molekyler forbedres, især i celler ^4,18. Der er således behov for at opdage eller udvikle mere potente, isozymeselektive DNMT-hæmmere.

En hindring for at opdage nye små molekylehæmmere af DNMT’er er de besværlige assays, der traditionelt bruges til at undersøge DNMT-aktivitet²⁸. Assays er normalt diskontinuerlige med flere trin. Den enzymatiske aktivitet af DNMT’er analyseres stadig rutinemæssigt ved anvendelse af radioaktivt S-adenosylmethionin (SAM)^{29,30,31,32,33,34}. Ikke-radioaktive assays til DNA-methylering er også blevet udviklet. For eksempel er assays, der anvender methylfølsomme begrænsningsendonukleaser og elektroforese til at adskille fordøjelsesprodukterne, blevet beskrevet^35,36. Disse typer diskontinuerlige, multistep assays er ikke let modtagelige for lægemiddelopdagelse. Siden midten af 2000’erne er der udviklet flere DNA-methyleringsassays med en højere gennemstrømning²⁸. Et scintillationsnærhedsassay blev brugt til at screene for DNMT1-hæmmere³⁷. Et andet assay ved hjælp af en methylfølsom restriktionsendonuklease blev brugt til at screene for DNMT3a-hæmmere^25,38. Mens begge assays tillod højere gennemstrømning end traditionelle DNA-methyleringsassays, kræver assays flere trin og tillader ikke observation af methyleringsaktivitet i realtid. For nylig er der beskrevet et kontinuerligt kinetikassay, der kobler dannelsen af S-adenosylhomocystein (SAH), et produkt af methyleringsreaktionen, til den spektroskopiske ændring ved 340 nm forbundet med NADPH-oxidation³⁹. Dette assay bruger tre koblingsenzymer til at generere et spektroskopisk signal.

Vi udviklede et fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay, der anvender et enkelt kommercielt tilgængeligt koblingsenzym og kan generere data i realtid (figur 1). Et hårnål oligonukleotid indeholdende tre methylcytosiner anvendes som substrat. Substrat-DNA’et indeholder en fluorophore i 5′-enden og en slukker i 3′-enden. Methylering af det hemimethylerede CpG-sted genererer spaltningsstedet for endonuklease Gla I – fuldt methyleret GCGC. Gla I-spaltning af produktet oligonukleotid frigiver fluoroforen fra slukningsenheden og genererer fluorescens i realtid. Analysen kan bruges til at undersøge aktiviteten af enhver isoform af DNMT; der observeres dog højere aktivitet med DNMT1, da dette isozyme fortrinsvis methylerer hemimethyleret DNA ^1,5. Endnu mere robust aktivitet observeres, hvis det autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) domæne fjernes fra DNMT1. Dette domæne, der findes i den N-terminale regulatoriske region, binder til det katalytiske sted og forhindrer DNA-binding. Fjernelse af de første ~600 aminosyrer resulterer i et afkortet enzym, der er signifikant mere aktivt end enzymet i fuld længde (~640 gange stigning i k_kat/K_m)⁴⁰. Denne aktiverede form af enzymet, kaldet RFTS-manglende DNMT1 (aminosyrer 621–1616), giver mulighed for lettere identifikation af hæmmere på grund af dets øgede katalytiske kraft. Dette papir præsenterer en protokol til at bruge RFTS-manglende DNMT1 i assays til at screene for potentielle små molekylehæmmere. Ved anvendelse af det endonukleasekoblede kontinuerlige assay bestemmes starthastigheden i nærvær og fravær af nogle få små molekyler. Hver potentiel hæmmer undersøges ved to koncentrationer for at se efter koncentrationsafhængig DNMT1-hæmning. Den procentvise aktivitet, der blev observeret i nærværelse af de små molekyler, blev beregnet i hvert enkelt tilfælde.

Figur 1: DNA-methyleringsassay. Et hemimethyleret hårnål-DNA med en fluorophore i 5′-enden og en quencher i 3′-enden bruges som substrat. DNMT1 katalyserer overførslen af methylgruppen fra S-adenosylmethionin til det ikke-methylerede CpG-sted og genererer S-adenosylhomocystein og fuldt methyleret DNA. DNA-produktet indeholder spaltningsstedet for endonuklease Gla I, som spalter fuldt methylerede GCGC-steder. Spaltning af produkt-DNA’et frigiver 5′-fluoroforen fra 3′-slukningsenheden og genererer fluorescens. Forkortelser: Fl = fluorophore; Q = quencher; DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionin; SAH = S-adenosylhomocystein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Forbered analyseløsninger til skærmen BEMÆRK: Koncentrationerne af substrater, der anvendes i dette assay, kan tilpasses. For RFTS-manglende DNMT1 er de eksperimentelt bestemte Km-værdier for hårnålens DNA-substrat og SAM 1-2 nM og 2 μM, henholdsvis26,40. Der fremstilles 600 μL af hver analysetilstand, der testes i mikrocentrifugerør på is.BEMÆRK: Den samlede mængde analyseopløs…

Representative Results

Aktiv DNMT1 er en forudsætning for denne analyse. RFTS-manglende DNMT1 blev udtrykt i E.coli og oprenset til homogenitet efter tidligere offentliggjorte procedurer41. For at sikre, at det oprensede enzym var aktivt, blev et diskontinuerligt endonukleasekoblet assay brugt til at undersøge DNA-methyleringsaktivitet36. Dette assay anvender et 32 basepar duplex DNA med en enkelt hemimethyleret CpG placeret i et Sau3A1 spaltningssted. Sau3A1 kan spalte det hemimethyle…

Discussion

For at identificere og karakterisere hæmmere af DNA-methyltransferaser skal enzymets aktivitet måles. Der findes flere metoder til undersøgelse af DNA-methyltransferaseaktivitet. Aktivitet overvåges almindeligvis ved hjælp af radioaktivitet; overførsel af den mærkede methylgruppe af SAM kan kvantificeres 29,30,31,32,33,34.^</…

Materials

96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates	ThermoFisher	249570
Bovine Serum Albumin	NEB	B9000S
compound 1	ChemBridge	5812086	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2	ChemBridge	6722175	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3	ChemBridge	5249376	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	methyl-sensitive endonuclease
Glycerol	RPI	G22025
Magnesium Chloride	Sigma	M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	custom synthesized	internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate	Sigma	G1501
S-adenosylmethionine	Sigma	A4377	methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base	RPI	T60040