Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Summary

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l’inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un’endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l’attività enzimatica in tempo reale.

Abstract

La metilazione del DNA, una forma di regolazione genica epigenetica, è importante per la normale funzione cellulare. Nelle cellule, le proteine chiamate DNA metiltransferasi (DNMT) stabiliscono e mantengono il modello di metilazione del DNA. Le modifiche al normale modello di metilazione del DNA sono legate allo sviluppo e alla progressione del cancro, rendendo i DNMT potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Pertanto, identificare e caratterizzare nuovi inibitori di piccole molecole di questi enzimi è di grande importanza. Questo documento presenta un protocollo che può essere utilizzato per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi. Il test di cinetica accoppiata continua consente di determinare le velocità iniziali di metilazione del DNA in presenza e assenza di potenziali inibitori di piccole molecole. Il test utilizza l’endonucleasi metil-sensibile Gla I per accoppiare la metilazione di un substrato di DNA emimetilato alla generazione di fluorescenza.

Questo test continuo consente di monitorare l’attività enzimatica in tempo reale. Condurre il test in piccoli volumi in piastre di microtitolazione riduce il costo dei reagenti. Utilizzando questo test, è stato condotto un piccolo esempio di screening per gli inibitori di DNMT1, l’isoenzima DNMT più abbondante nell’uomo. Il prodotto naturale antrachinone altamente sostituito, l’acido laccaico A, è un potente inibitore competitivo del DNA di DNMT1. Qui, esaminiamo tre potenziali inibitori di piccole molecole – antrachinoni o molecole simili all’antrachinone con uno o tre sostituenti – a due concentrazioni per descrivere il protocollo di analisi. Le velocità iniziali vengono utilizzate per calcolare l’attività percentuale osservata in presenza di ciascuna molecola. Uno dei tre composti esaminati mostra un’inibizione concentrazione-dipendente dell’attività di DNMT1, indicando che si tratta di un potenziale inibitore di DNMT1.

Introduction

La metilazione del DNA è un importante marchio epigenetico che regola l’espressione genica e la struttura della cromatina. La metilazione si verifica prevalentemente nei dinucleotidi CpG – citosina seguita da guanosina; Il gruppo metilico viene aggiunto alla posizione 5 della citosina. Sono necessari corretti modelli di metilazione del DNA, e quindi una corretta espressione genica, per un appropriato sviluppo e funzione cellulare. Molti stati patologici sono stati associati a cambiamenti nel normale modello di metilazione ^1,2,3. Ad esempio, esiste un legame tra l’inizio e la progressione del cancro e le alterazioni del modello di metilazione del DNA. Tipicamente, le cellule tumorali mostrano livelli complessivi più bassi di metilcitosina, che contribuisce all’instabilità del genoma. Allo stesso tempo, la metilcitosina presente nel genoma è concentrata nelle regioni promotrici dei geni oncosoppressori, che porta al silenziamento genico di queste importanti proteine. In particolare, i cambiamenti epigenetici sono dinamici e reversibili, a differenza delle mutazioni del DNA associate alla tumorigenesi. Ciò ha reso le proteine coinvolte nella regolazione genica epigenetica interessanti bersagli farmacologici ^2,4.

Le DNA metiltransferasi (DNMT) sono le proteine responsabili della generazione e del mantenimento dei modelli di metilazione del DNA. Tre isoenzimi cataliticamente attivi, DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, esistono negli esseri umani. Durante lo sviluppo e la differenziazione, le metiltransferasi de novo, DNMT3a e DNMT3b, stabiliscono modelli di metilazione. Entrambi gli enzimi possono legare la proteina DNMT3L cataliticamente inattiva per formare complessi che mostrano una maggiore attività ^1,5. Dopo la divisione cellulare, le cellule figlie contengono DNA emimetilato – DNA contenente metilcitosina in un solo filamento del duplex – perché il DNA appena sintetizzato è privo di segni di metilazione. La funzione principale di DNMT1 è quella di metilare questo DNA emimetilato, ristabilendo così il modello di metilazione completo ^1,5.

I legami tra l’attività di DNMT e il cancro sono ben stabiliti. La sovraespressione di DNMT1, sia attraverso meccanismi trascrizionali che post-traduzionali, è una conseguenza di diverse vie oncogeniche comuni 6,7,8,9. Gli approcci genetici per ridurre l’attività di DNMT1 utilizzando alleli ipomorfici determinano una diminuzione della formazione di tumore nei topi Apc ^{(Min) 10}. Gli oligonucleotidi antisenso che abbattono DNMT1 inibiscono la neoplasia in colture cellulari e modelli tumorali murini^11,12. Pertanto, l’inibizione dell’attività DNMT1 sembra un approccio promettente alla terapia del cancro. Tuttavia, i ruoli che gli isoenzimi DNMT3 svolgono non sono così semplici. Le mutazioni di DNMT3a si trovano nella leucemia mieloide acuta¹³ e nella sindrome mielodisplastica¹⁴. Almeno una delle mutazioni identificate ha dimostrato di diminuire l’attività di metilazione del DNA dell’enzima¹⁵. Tuttavia, DNMT3b è sovraespresso nel cancro al seno¹⁶ e nel cancro del colon-retto¹⁷. Con i vari isoenzimi DNMT che svolgono ruoli diversi nella carcinogenesi, l’identificazione di inibitori isoenzimatici specifici sarà fondamentale. Non solo questi composti saranno utili per lo sviluppo di terapie, ma gli inibitori isoenzimatico-specifici sarebbero anche uno strumento inestimabile per analizzare il ruolo di ciascun isoenzima DNMT nell’eziologia del cancro.

In letteratura sono stati riportati diversi inibitori della DNMT. Gli inibitori DNMT noti possono essere suddivisi in due classi: nucleoside e non nucleoside. Gli inibitori nucleosidici sono tipicamente analoghi della citidina. Questi composti sono incorporati nel DNA e intrappolano covalentemente i DNMT. 5-azacitidina e 5-aza-2′-deossicitidina sono stati approvati per il trattamento della sindrome mielodisplastica e della leucemia mieloide acuta ^4,18. L’elevata tossicità, la bassa biodisponibilità e l’instabilità chimica di questi composti presentano problemi. Il lavoro in corso sta esaminando l’efficacia della prossima generazione di inibitori nucleosidici; SGI-110, derivato dalla 5-aza-2′-deossicitidina, è un esempio ^19,20. Gli inibitori nucleosidici non sono isoenzimo-specifici e inattiveranno qualsiasi isoenzima DNMT incontrato. Pertanto, il trattamento con un agente nucleosidico demetilante determina la deplezione di tutti gli isoenzimi DNMT ^4,18. Gli inibitori non nucleosidici non hanno bisogno di essere incorporati nel DNA per esercitare i loro effetti inibitori. Invece, queste molecole si legano direttamente ai DNMT, introducendo la possibilità di inibizione isoenzima-specifica. Diversi inibitori non-nucleosidici sono stati scoperti fino ad oggi, tra cui SGI-1027 21, idralazina 22, procainamide 23, RG108 e derivati 24, e prodotti naturali, (-)-epigallocatechina 3-gallato (EGCG)²⁵ e acido laccaico A ^26,27. La maggior parte degli inibitori non nucleosidici scoperti fino ad oggi non sono isoenzimi-selettivi o mostrano preferenze deboli per un isoenzima DNMT. Inoltre, la potenza di queste molecole deve essere migliorata, specialmente nelle cellule ^4,18. Pertanto, vi è la necessità di scoprire o sviluppare inibitori DNMT più potenti e isoenzimatici.

Un ostacolo alla scoperta di nuovi inibitori di piccole molecole di DNMT sono i laboriosi saggi tradizionalmente utilizzati per esaminare l’attività DNMT²⁸. I saggi sono generalmente discontinui con più passaggi. L’attività enzimatica dei DNMT viene ancora regolarmente analizzata utilizzando S-adenosil metionina radioattiva (SAM)^{29,30,31,32,33,34}. Sono stati sviluppati anche saggi non radioattivi per la metilazione del DNA. Ad esempio, sono stati descritti saggi che utilizzano endonucleasi di restrizione metil-sensibile ed elettroforesi per separare i prodotti della digestione^35,36. Questi tipi di saggi discontinui e multistep non sono facilmente suscettibili di scoperta di farmaci. Dalla metà degli anni 2000, sono stati sviluppati diversi saggi di metilazione del DNA con un throughput più elevato²⁸. Un saggio di prossimità a scintillazione è stato utilizzato per lo screening degli inibitori DNMT1³⁷. Un altro test che utilizza un’endonucleasi di restrizione metil-sensibile è stato utilizzato per lo screening degli inibitori DNMT3a^25,38. Mentre entrambi i test hanno consentito una maggiore produttività rispetto ai tradizionali test di metilazione del DNA, i test richiedono più passaggi e non consentono l’osservazione dell’attività di metilazione in tempo reale. Più recentemente, è stato descritto un saggio cinetico continuo che accoppia la formazione di S-adenosilomocisteina (SAH), un prodotto della reazione di metilazione, al cambiamento spettroscopico a 340 nm associato all’ossidazione NADPH³⁹. Questo test utilizza tre enzimi di accoppiamento per generare un segnale spettroscopico.

Abbiamo sviluppato un saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi basato sulla fluorescenza che utilizza un singolo enzima di accoppiamento disponibile in commercio e può generare dati in tempo reale (Figura 1). Un oligonucleotide a forcina contenente tre metilcitosine viene utilizzato come substrato. Il DNA del substrato contiene un fluoroforo all’estremità 5′ e un quencher all’estremità 3′. La metilazione del sito CpG emimetilato genera il sito di scissione per l’endonucleasi Gla I – GCGC completamente metilato. La scissione Gla I dell’oligonucleotide prodotto rilascia il fluoroforo dal quencher e genera fluorescenza in tempo reale. Il test può essere utilizzato per esaminare l’attività di qualsiasi isoforma di DNMT; tuttavia, si osserva una maggiore attività con DNMT1 poiché questo isoenzima metila preferenzialmente il DNA emimetilato ^1,5. Un’attività ancora più robusta si osserva se il dominio RFTS (Replication Foci Targeting Sequence) autoinibitorio viene rimosso da DNMT1. Questo dominio, che si trova nella regione regolatoria N-terminale, si lega al sito catalitico e impedisce il legame del DNA. La rimozione dei primi ~ 600 amminoacidi si traduce in un enzima troncato che è significativamente più attivo dell’enzima a lunghezza intera (aumento di ~ 640 volte in k_cat / K_m)⁴⁰. Questa forma attivata dell’enzima, denominata DNMT1 privo di RFTS (aminoacidi 621-1616), consente una più facile identificazione degli inibitori grazie al suo maggiore potere catalitico. Questo articolo presenta un protocollo per utilizzare DNMT1 privo di RFTS nei saggi per lo screening di potenziali inibitori di piccole molecole. Utilizzando il saggio continuo accoppiato all’endonucleasi, la velocità iniziale viene determinata in presenza e assenza di alcune piccole molecole. Ogni potenziale inibitore viene esaminato a due concentrazioni per cercare l’inibizione DNMT1 dipendente dalla concentrazione. La percentuale di attività osservata in presenza delle piccole molecole è stata calcolata in ciascun caso.

Figura 1: Saggio di metilazione del DNA. Come substrato viene utilizzato un DNA a forcina emimetilata con un fluoroforo all’estremità 5′ e un quencher all’estremità 3′. DNMT1 catalizza il trasferimento del gruppo metilico dalla S-adenosilmetionina al sito CpG non metilato, generando S-adenosilomocisteina e DNA completamente metilato. Il prodotto del DNA contiene il sito di scissione per l’endonucleasi Gla I, che fende i siti GCGC completamente metilati. La scissione del DNA del prodotto rilascia il fluoroforo 5′ dal quencher 3′, generando fluorescenza. Abbreviazioni: Fl = fluoroforo; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; SAM = S-adenosilmetionina; SAH = S-adenosilomocisteina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

1. Preparare soluzioni di analisi per lo schermo NOTA: Le concentrazioni dei substrati utilizzati in questo test possono essere adattate. Per DNMT1 privo di RFTS, i valori di Km determinati sperimentalmente per il substrato del DNA hairpin e SAM sono 1-2 nM e 2 μM, rispettivamente26,40. Preparare 600 μL di ciascuna condizione di analisi da testare in provette da microcentrifuga su ghiaccio.NO…

Representative Results

DNMT1 attivo è un prerequisito per questa analisi. Il DNMT1 privo di RFTS è stato espresso in E.coli e purificato fino ad omogeneità seguendo procedure precedentemente pubblicate41. Per garantire che l’enzima purificato fosse attivo, è stato utilizzato un saggio discontinuo accoppiato a endonucleasi per esaminare l’attività di metilazione del DNA36. Questo test utilizza un DNA duplex a 32 coppie di basi con un singolo CpG emimetilato posizionato in un sito di …

Discussion

Per identificare e caratterizzare gli inibitori delle DNA metiltransferasi, deve essere misurata l’attività dell’enzima. Esistono diversi metodi per esaminare l’attività della DNA metiltransferasi. L’attività è comunemente monitorata utilizzando la radioattività; il trasferimento del gruppo metilico marcato di SAM può essere quantificato 29,30,31,32,33,34.^</su…

Materials

96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates	ThermoFisher	249570
Bovine Serum Albumin	NEB	B9000S
compound 1	ChemBridge	5812086	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2	ChemBridge	6722175	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3	ChemBridge	5249376	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	methyl-sensitive endonuclease
Glycerol	RPI	G22025
Magnesium Chloride	Sigma	M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	custom synthesized	internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate	Sigma	G1501
S-adenosylmethionine	Sigma	A4377	methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base	RPI	T60040