Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Summary

Les ADN méthyltransférases sont des cibles potentielles de médicaments anticancéreux. Ici, un protocole est présenté pour évaluer les petites molécules pour l’inhibition de l’ADN méthyltransférase. Ce test utilise une endonucléase pour coupler la méthylation de l’ADN à la génération de fluorescence et permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel.

Abstract

La méthylation de l’ADN, une forme de régulation épigénétique des gènes, est importante pour la fonction cellulaire normale. Dans les cellules, des protéines appelées ADN méthyltransférases (DNMT) établissent et maintiennent le schéma de méthylation de l’ADN. Les changements dans le schéma normal de méthylation de l’ADN sont liés au développement et à la progression du cancer, ce qui fait des DNMT des cibles potentielles pour les médicaments anticancéreux. Ainsi, l’identification et la caractérisation de nouvelles petites molécules inhibitrices de ces enzymes sont d’une grande importance. Cet article présente un protocole qui peut être utilisé pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase. Le test cinétique couplé continu permet de déterminer les vitesses initiales de méthylation de l’ADN en présence et en l’absence d’inhibiteurs potentiels de petites molécules. Le test utilise l’endonucléase méthyl-sensible Gla I pour coupler la méthylation d’un substrat d’ADN hémiméthylé à la génération de fluorescence.

Ce test continu permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel. La réalisation du test en petits volumes dans des plaques de microtitrage réduit le coût des réactifs. À l’aide de ce test, un petit exemple de dépistage a été effectué pour les inhibiteurs de DNMT1, l’isozyme DNMT le plus abondant chez l’homme. Le produit naturel anthraquinone hautement substitué, l’acide laccaïque A, est un puissant inhibiteur de DNMT1 compétitif pour l’ADN. Ici, nous examinons trois inhibiteurs potentiels de petites molécules – anthraquinones ou molécules semblables à l’anthraquinone avec un à trois substituants – à deux concentrations pour décrire le protocole de dosage. Les vitesses initiales sont utilisées pour calculer le pourcentage d’activité observé en présence de chaque molécule. L’un des trois composés examinés présente une inhibition dépendante de la concentration de l’activité DNMT1, ce qui indique qu’il s’agit d’un inhibiteur potentiel de DNMT1.

Introduction

La méthylation de l’ADN est une marque épigénétique importante qui régule l’expression des gènes et la structure de la chromatine. La méthylation se produit principalement dans les dinucléotides CpG – cytosine suivie de guanosine; Le groupe méthyle est ajouté à la position 5 de la cytosine. Des schémas de méthylation corrects de l’ADN, et donc une expression génique appropriée, sont nécessaires pour un développement et une fonction cellulaires appropriés. De nombreux états pathologiques ont été associés à des modifications du schéma normal de méthylation ^1,2,3. Par exemple, il existe un lien entre l’initiation et la progression du cancer et les altérations du schéma de méthylation de l’ADN. En règle générale, les cellules cancéreuses présentent des niveaux globaux plus faibles de méthylcytosine, ce qui contribue à l’instabilité du génome. Dans le même temps, la méthylcytosine présente dans le génome est concentrée dans les régions promotrices des gènes suppresseurs de tumeurs, ce qui conduit au silençage génique de ces protéines importantes. Notamment, les changements épigénétiques sont dynamiques et réversibles, contrairement aux mutations de l’ADN associées à la tumorigenèse. Cela a rendu les protéines impliquées dans la régulation des gènes épigénétiques intéressantes^{cibles médicamenteuses 2,4}.

Les ADN méthyltransférases (DNMT) sont les protéines responsables de la génération et du maintien des schémas de méthylation de l’ADN. Trois isoenzymes catalytiquement actifs, DNMT1, DNMT3a et DNMT3b, existent chez l’homme. Au cours du développement et de la différenciation, les méthyltransférases de novo, DNMT3a et DNMT3b, établissent des schémas de méthylation. Les deux enzymes peuvent lier la protéine DNMT3L catalytiquement inactive pour former des complexes qui présentent une activité accrue ^1,5. Après la division cellulaire, les cellules filles contiennent de l’ADN hémiméthylé – de l’ADN contenant de la méthylcytosine dans un seul brin du duplex – parce que l’ADN nouvellement synthétisé est dépourvu de marques de méthylation. La fonction principale de DNMT1 est de méthyler cet ADN hémiméthylé, rétablissant ainsi le schéma de méthylation complet ^1,5.

Les liens entre l’activité DNMT et le cancer sont bien établis. La surexpression de DNMT1, que ce soit par des mécanismes transcriptionnels ou post-traductionnels, est une conséquence de plusieurs voies oncogéniques courantes 6,7,8,9. Les approches génétiques visant à réduire l’activité de DNMT1 à l’aide d’allèles hypomorphiques entraînent une diminution de la formation tumorale chez les souris Apc^(Min)10. Les oligonucléotides antisens qui neutralisent DNMT1 inhibent la néoplasie dans la culture cellulaire et les modèles tumoraux^{de souris 11,12}. Ainsi, l’inhibition de l’activité DNMT1 semble être une approche prometteuse de traitement du cancer. Cependant, les rôles que jouent les isoenzymes DNMT3 ne sont pas si simples. Les mutations DNMT3a sont retrouvées dans la leucémie myéloïde aiguë¹³ et le syndrome myélodysplasique¹⁴. Il a été démontré qu’au moins une des mutations identifiées diminue l’activité de méthylation de l’ADN de l’enzyme¹⁵. Cependant, DNMT3b est surexprimé dans le cancer du sein¹⁶ et le cancer colorectal¹⁷. Les différents isoenzymes DNMT jouant différents rôles dans la cancérogenèse, l’identification des inhibiteurs spécifiques de l’isozyme sera essentielle. Non seulement ces composés seront utiles pour le développement de produits thérapeutiques, mais les inhibiteurs spécifiques à l’isozyme seraient également un outil précieux pour disséquer le rôle de chaque isozyme DNMT dans l’étiologie du cancer.

Plusieurs inhibiteurs de DNMT ont été rapportés dans la littérature. Les inhibiteurs connus de la DNMT peuvent être divisés en deux classes : nucléosidiques et non nucléosidiques. Les inhibiteurs nucléosidiques sont généralement des analogues de la cytidine. Ces composés sont incorporés dans l’ADN et piègent par covalence les DNMT. La 5-azacytidine et la 5-aza-2′-désoxycytidine ont été approuvées pour le traitement du syndrome myélodysplasique et de la leucémie myéloïde aiguë ^4,18. La toxicité élevée, la faible biodisponibilité et l’instabilité chimique de ces composés posent des problèmes. Les travaux en cours examinent l’efficacité de la prochaine génération d’inhibiteurs nucléosidiques; SGI-110, dérivé de la 5-aza-2′-désoxycytidine, en est un exemple^19,20. Les inhibiteurs nucléosidiques ne sont pas spécifiques à l’isozyme et inactiveront tout isozyme DNMT rencontré. Par conséquent, le traitement avec un agent déméthylant des nucléosides entraîne l’épuisement de tous les isoenzymes DNMT ^4,18. Les inhibiteurs non nucléosidiques n’ont pas besoin d’être incorporés dans l’ADN pour exercer leurs effets inhibiteurs. Au lieu de cela, ces molécules se lient directement aux DNMT, introduisant la possibilité d’une inhibition spécifique de l’isozyme. Plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques ont été découverts à ce jour, notamment SGI-1027 21, hydralazine²², procaïnamide 23, RG108 et dérivés 24, et des produits naturels, (−)-épigallocatéchine 3-gallate (EGCG)25 et acide laccaïque A^26,27. La plupart des inhibiteurs non nucléosidiques découverts à ce jour ne sont pas isozymes-sélectifs ou présentent de faibles préférences pour un isozyme DNMT. De plus, la puissance de ces molécules doit être améliorée, en particulier dans les cellules ^4,18. Il est donc nécessaire de découvrir ou de développer des inhibiteurs de DNMT isozymes-sélectifs plus puissants.

Un obstacle à la découverte de nouvelles petites molécules inhibitrices de DNMT est les tests laborieux traditionnellement utilisés pour examiner l’activité DNMT²⁸. Les tests sont généralement discontinus avec plusieurs étapes. L’activité enzymatique des DNMT est encore systématiquement dosée à l’aide de S-adénosylméthionine (SAM) radioactive29,30,31,32,33,34. Des tests non radioactifs pour la méthylation de l’ADN ont également été développés. Par exemple, des essais utilisant des endonucléases de restriction méthylsensibles et l’électrophorèse pour séparer les produits de digestion ont été décrits^35,36. Ces types de tests discontinus en plusieurs étapes ne se prêtent pas facilement à la découverte de médicaments. Depuis le milieu des années 2000, plusieurs tests de méthylation de l’ADN avec un débit plus élevé ont été développés²⁸. Un test de proximité par scintillation a été utilisé pour dépister les inhibiteurs de DNMT1³⁷. Un autre essai utilisant une endonucléase de restriction méthylsensible a été utilisé pour dépister les inhibiteurs de DNMT3a^25,38. Bien que les deux essais aient permis un débit plus élevé que les tests traditionnels de méthylation de l’ADN, les essais nécessitent plusieurs étapes et ne permettent pas d’observer l’activité de méthylation en temps réel. Plus récemment, un essai cinétique continu a été décrit qui couple la formation de S-adénosylhomocystéine (SAH), un produit de la réaction de méthylation, au changement spectroscopique à 340 nm associé à l’oxydation du NADPH³⁹. Ce test utilise trois enzymes de couplage pour générer un signal spectroscopique.

Nous avons développé un test de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase basé sur la fluorescence qui utilise une seule enzyme de couplage disponible dans le commerce et peut générer des données en temps réel (Figure 1). Un oligonucléotide en épingle à cheveux contenant trois méthylcytosines est utilisé comme substrat. L’ADN du substrat contient un fluorophore à l’extrémité 5′ et un quencher à l’extrémité 3′. La méthylation du site CpG hémiméthylé génère le site de clivage de l’endonucléase Gla I — GCGC entièrement méthylée. Le clivage Gla I de l’oligonucléotide produit libère le fluorophore de l’anti-quencher et génère une fluorescence en temps réel. Le test peut être utilisé pour examiner l’activité de toute isoforme de DNMT; cependant, une activité plus élevée est observée avec DNMT1 car cet isozyme méthyle préférentiellement l’ADN hémiméthylé ^1,5. Une activité encore plus robuste est observée si le domaine autoinhibiteur de la séquence de ciblage des foyers de réplication (RFTS) est supprimé de DNMT1. Ce domaine, trouvé dans la région régulatrice N-terminale, se lie au site catalytique et empêche la liaison à l’ADN. L’élimination des premiers ~600 acides aminés donne une enzyme tronquée qui est significativement plus active que l’enzyme pleine longueur (~640 fois plus de k_cat/K_m)⁴⁰. Cette forme activée de l’enzyme, appelée DNMT1 dépourvu de RFTS (acides aminés 621-1616), permet d’identifier plus facilement les inhibiteurs en raison de son pouvoir catalytique accru. Cet article présente un protocole d’utilisation du DNMT1 dépourvu de RFTS dans les tests de dépistage des inhibiteurs potentiels de petites molécules. À l’aide du test continu couplé à l’endonucléase, la vitesse initiale est déterminée en présence et en l’absence de quelques petites molécules. Chaque inhibiteur potentiel est examiné à deux concentrations pour rechercher une inhibition du DNMT1 dépendante de la concentration. Le pourcentage d’activité observé en présence des petites molécules a été calculé dans chaque cas.

Figure 1 : Essai de méthylation de l’ADN. Un ADN d’épingle à cheveux hémiméthylé avec un fluorophore à l’extrémité 5′ et un désincant à l’extrémité 3′ est utilisé comme substrat. DNMT1 catalyse le transfert du groupe méthyle de la S-adénosylméthionine au site CpG non méthylé, générant de la S-adénosylhomocystéine et de l’ADN entièrement méthylé. Le produit d’ADN contient le site de clivage de l’endonucléase Gla I, qui clive les sites GCGC entièrement méthylés. Le clivage de l’ADN du produit libère le fluorophore 5′ de l’anti-quencher 3′, générant une fluorescence. Abréviations : Fl = fluorophore; Q = quencher; DNMT1 = ADN méthyltransférase 1; SAM = S-adénosylméthionine; HSA = S-adénosylhomocystéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Préparer les solutions de dosage pour le criblage NOTE: Les concentrations de substrats utilisés dans ce test peuvent être adaptées. Pour le DNMT1 dépourvu de RFTS, les valeurs Km déterminées expérimentalement pour le substrat d’ADN en épingle à cheveux et SAM sont de 1–2 nM et 2 μM, respectivement26,40. Préparer 600 μL de chaque condition d’essai testée dans des tubes à mic…

Representative Results

Le DNMT1 actif est une condition préalable à cette analyse. Le DNMT1 dépourvu de RFTS a été exprimé dans E. coli et purifié à l’homogénéité selon les procédures précédemment publiées41. Pour s’assurer que l’enzyme purifiée était active, un test discontinu couplé à l’endonucléase a été utilisé pour examiner l’activité de méthylation de l’ADN36. Ce test utilise un ADN duplex de 32 paires de bases avec un seul CpG hémiméthylé po…

Discussion

Pour identifier et caractériser les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférases, l’activité de l’enzyme doit être mesurée. Il existe plusieurs méthodes d’examen de l’activité de l’ADN méthyltransférase. L’activité est généralement surveillée à l’aide de la radioactivité; Le transfert du groupe méthyle marqué de SAM peut être quantifié 29,30,31,32,33,34…

Materials

96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates	ThermoFisher	249570
Bovine Serum Albumin	NEB	B9000S
compound 1	ChemBridge	5812086	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2	ChemBridge	6722175	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3	ChemBridge	5249376	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	methyl-sensitive endonuclease
Glycerol	RPI	G22025
Magnesium Chloride	Sigma	M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	custom synthesized	internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate	Sigma	G1501
S-adenosylmethionine	Sigma	A4377	methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base	RPI	T60040